番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）對3種殺菌劑的抗性監測及交互抗藥性研究

魏佳爽，袁善奎，向冰峰，朱志峰

（農業農村部農藥檢定所，北京 100125）

番茄灰霉病是一種世界性的真菌病害，主要由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea） 侵染引起。該病害在國內外早有報道，已成為設施農業上一種重要病害，發生嚴重時可減產40%～50%，甚至絕產，給農業生產帶來巨大損失，是番茄生產中最具毀滅性的病害之一[1]。灰葡萄孢菌的寄主范圍廣，可導致500多種植物病害，其中農作物超過200種[2]。目前化學防治仍是控制該病害的主要手段。由于灰葡萄孢具有繁殖力強、變異速度快等特點，被殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）歸入高抗性風險病原菌[3]。在山西、上海等地區已發現其對多菌靈、腐霉利、嘧霉胺、氟吡菌酰胺、嘧菌酯、啶酰菌胺等多種殺菌劑產生了不同程度抗性[4-7］。

隨著生產上番茄灰霉病菌對多菌靈、乙霉威等一些傳統藥劑不斷產生抗性，嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑等藥劑已成為生產上防治該病的主要藥劑品種。本研究采用菌絲生長速率法，分別測定了采自河南省和江蘇省8個不同地市番茄種植區的158株番茄灰霉病菌對上述3種藥劑的敏感性，分析了不同地區菌株的敏感性差異及交互抗性情況，以期為番茄灰霉病的科學合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

2019年，從江蘇淮安、江蘇東臺、江蘇泰州、河南洛陽、河南許昌、河南開封、河南鄭州、河南新鄉等8地的番茄種植基地隨機采集已感染灰霉病的病果共220個，參考文獻方法[8-9]對灰霉病菌進行分離、鑒定和保存，共分離得到158個擔孢菌株。所有菌株均在4℃下保存于PDA斜面中待用。

1.1.2 供試藥劑

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），北京奧博星生物技術有限公司。其用于菌株培養及菌絲生長抑制試驗。

1.2 試驗方法

筆者采用菌絲生長速率法[10]。各菌株先在PDA平板上預培養5 d，然后制取直徑6 mm的菌餅，菌絲朝下分別接入含系列濃度嘧菌酯（同時含100 μg/mL SHAM）、啶酰菌胺、啶菌唑的PDA平板上。每皿接種1個菌餅，每處理重復3次，以不含藥劑的PDA平板為對照。25℃下培養5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 番茄灰霉病菌抗藥菌株對不同殺菌劑間的交互抗性測定

其次，從供試菌株中選擇5株對嘧菌酯敏感性不同的菌株，采用1.2.1所述的菌絲生長速率法分別測定其對其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯的敏感性；另從供試菌株中選擇5株對啶酰菌胺敏感性不同的菌株，分別測定其對其他琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類殺菌劑如萎銹靈、氟吡菌酰胺、噻呋酰胺的敏感性。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行處理與分析，采用該軟件描述統計模塊進行Shapiro-Wilk法（W法）正態性檢驗，P＞0.05則符合正態分布，反之則為非正態分布；通過probit模塊計算藥劑抑制病原菌菌絲生長的毒力回歸方程（y=A＋Bx）、相關系數和EC50值。

2 結果與分析

2.1 田間番茄灰霉病菌對3種殺菌劑的敏感性及抗性

敏感性測定結果表明，158個番茄灰霉病菌菌株對嘧菌酯的EC50值在0.0045～90.5 μg/mL，平均EC50值為9.80±21.1 μg/mL，最高值為最低值的2.0×105倍；對啶酰菌胺的EC50值在0.0576～36.8 μg/mL，平均EC50值為2.56±6.35 μg/mL，最高值為最低值的639倍；對啶菌唑的EC50值在0.0169～2.64 μg/mL，平均值為0.13±0.23 μg/mL，最高值為最低值的156倍。在供試的3種殺菌劑中，對于敏感菌株而言，均具有較高活性，其中嘧菌酯對番茄灰霉病菌的活性最高，其次是啶酰菌胺和啶菌唑；但從整個群體的平均敏感性水平來看，番茄灰霉病菌群體對啶菌唑最敏感，其次是啶酰菌嘧菌酯，最后是嘧菌酯，說明病原菌對嘧菌酯出現了較高水平的抗性。158株番茄灰霉病菌對嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑的抗性頻率分別為19.0%、11.4%、0.6%。

將上述3個藥劑對158株番茄灰霉病菌的EC50值范圍劃分為7個區間，每個區間的菌株出現頻率見圖1。通過SPSS分析Shapiro-Wilk正態性檢驗結果，顯示菌株對嘧菌酯（W=0.905，P＜0.05）、對啶酰菌胺（W=0.815，P＜0.05）、對啶菌唑（W=0.946，P＜0.05）的敏感性頻次分布均不符合正態分布，表明不同番茄灰霉病菌對嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑的敏感性均出現了分化，并已出現敏感性降低的亞群體或抗性菌株。

圖1 158 株番茄灰霉病菌對3 種殺菌劑的敏感性頻次分布

2019年從江蘇省和河南省分別采集97株和61株番茄灰霉病菌株，2個地區的菌株對嘧菌酯和啶酰菌胺的敏感性差異較大，但對啶菌唑的平均敏感性接近（表1）。總體來說，江蘇地區的番茄灰霉病菌對嘧菌酯和啶酰菌胺出現了較嚴重的抗性問題，抗性菌株頻率分別為25.8%、18.6%，并且檢測到1株抗啶菌唑的抗性菌株；河南地區采集的番茄灰霉病菌中未檢測到對啶酰菌胺和啶菌唑的抗性菌株，僅檢測到5株抗嘧菌酯的抗性菌株，抗性頻率為8.2%。以上結果說明，在防治番茄灰霉病方面，江蘇的用藥水平要高于河南地區。

表1 江蘇和河南番茄灰霉病菌對3 種殺菌劑的敏感性及抗性情況

2.2 番茄灰霉病菌對不同殺菌劑的交互抗性2.2.1 番茄灰霉病菌對嘧菌酯、啶酰菌胺和啶菌唑的交互抗性

2.2.2 番茄灰霉病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的交互抗性

選擇5株對嘧菌酯敏感性不同的菌株，測定了其對醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯的敏感性。結果表明（表2），供試3種殺菌劑對5株番茄灰霉病菌菌絲生長的平均抑制活性依次為吡唑醚菌酯＞肟菌酯＞醚菌酯＞嘧菌酯，結果表明嘧菌酯與醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯均存在交互抗性。

表2 番茄灰霉病菌對4 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的交互抗性

2.2.3 番茄灰霉病菌對SDHI類殺菌劑的交互抗性

選擇5株對啶酰菌胺敏感性不同的菌株，測定了其對萎銹靈、氟吡菌酰胺、噻呋酰胺的敏感性（表3），結果表明,在SDHI類殺菌劑中，番茄灰霉病菌對啶酰菌胺最敏感，對另外3個藥劑的敏感性較低，但從整體趨勢來看，啶酰菌胺與萎銹靈和噻呋酰胺均存在交互抗性，而與氟吡菌酰胺不存在交互抗性。

2.3 番茄灰霉病菌對多藥抗性情況

3 小結與討論

通過試驗，供試的158個番茄灰霉病菌株中，有128株對嘧菌酯表現敏感，EC50值在0.0045～90.5 μg/mL，平均EC50值為0.81±1.27 μg/mL，這比Zhang等[11]報道的敏感性基線（2.24±1.29 μg/mL）更加敏感。另外30株表現抗性與敏感菌株的平均EC50值相比，抗性倍數在14～112倍，呈低抗到高抗趨勢；有140株對啶酰菌胺表現敏感，EC50值在0.0576～36.8 μg/mL，平均EC50值為0.54±0.36 μg/mL，與Zhang等[12]報道的敏感性基線（1.07±0.11 μg/mL）結果相比更加敏感。另外18株表現抗性與敏感菌株的平均EC50值相比，抗性倍數在11～68倍，呈低抗到中等抗趨勢；有157株對啶菌唑表現敏感，EC50值在0.0169～2.64 μg/mL，平均EC50值為0.106±0.095μg/mL，與馬建英等[13]報到的敏感性基線（0.1182±0.0363 μg/mL）結果一致。另外，從各藥劑的敏感性分布曲線來看，灰霉病菌對嘧菌酯的敏感群體的EC50差異較大，變化幅度較寬。

本研究表明，番茄灰霉病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑存在交互抗藥性，這與武東霞等[14]的研究結果一致，其發現灰葡萄孢菌對苯噻菌酯、嘧菌酯、醚菌酯和吡唑醚菌酯之間存在正交互抗性，但與不同作用機制的殺菌劑無交互抗性。另外，研究發現番茄灰霉病菌對部分SDHI類殺菌劑存在交互抗性，但由于部分SDHI對灰葡萄孢菌的活性較低，從而未表選處交互抗性情況。盡管本研究測定的大多數菌株對嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑仍表現敏感，但抗藥性菌株的出現表明采用這3種藥劑防治番茄灰霉病具有一定的風險性，而且已發現大量菌株存在多藥抗性現象，這將會導致一些混配藥劑失去防效。此外，由于番茄灰霉病菌具有繁殖速度快、遺傳變異大和適應性強等特點，極易對藥劑產生抗藥性，建議應加強番茄灰霉病對這幾類藥劑的敏感性監測，同時注意輪換或混合使用其他具有不同作用機制的藥劑，以減小對田間種群的選擇性壓力，延緩病原菌對該類藥劑的抗性發展。