上調脂蛋白酯酶基因對精神分裂癥大鼠的干預效果及作用機制研究

佘 意，余軍軍，呂 媛

(1.湖南省第二人民醫院精神科，中國 長沙 410007；2.湖南師范大學醫學院，分子流行病學湖南省重點實驗室，中國 長沙 410013)

精神分裂癥屬于一種較為常見的精神疾病，該病以精神活動與環境不協調為主要特征表現，患者多存在思維、知覺、情感及行為障礙，目前臨床上認為遺傳學變異、表現遺傳突變、環境因素相互作用下誘導精神分裂癥的發生，但其具體作用機制尚不完全明確[1]。研究表明，脂蛋白脂酶(LPL)為甘油三酯水解過程中的一種關鍵酶，其廣泛存在于大腦組織中的認知、記憶、學習等區域中，屬于血脂異常、冠心病、阿爾茲海默病的高危影響因素之一[2]。基于上述研究背景，本文研究上調LPL基因對精神分裂癥大鼠的干預效果及作用機制，以明確LPL基因與精神分裂癥的作用關系，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取60只SPF級SD雄性大鼠，8～12周齡，購自慕恩(廣州)生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK(粵)2020-0225，體重185～220 g，所有大鼠均在相對濕度為30%～50%、溫度為(23.8±1.5)℃的環境下預喂養7 d，每日光照12 h，分籠飼養。本研究獲我院倫理委員會批準，實驗操作嚴格按照動物實驗倫理要求相關規定進行。

主要試劑：LPL載體構建及慢病毒載體滴定由上海吉瑪公司完成；MK801購自美國Sigma公司；小鼠抗大鼠CREB抗體、兔抗大鼠p-CREB抗體、兔抗人BDNF抗體、兔抗大鼠TrkB抗體、小鼠抗大鼠p-TrkB抗體購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 LPL載體構建 使用GenBank查找序列獲得LPL基因序列，構建LPL下調轉染質粒、LPL上調轉染質粒，由上海吉瑪公司設計并合成，并做慢病毒滴度測定(病毒滴度為1×1012TU·L-1)。LPL引物序列:上游:5’-CTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGT-3’，下游：5’-ACTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’;LPL引物序列:上游:5’-CGCTTCTTTGCCAACATCGT-3’，下游：5’-ACACTCCATGCTGTCATCTTGA-3’。

1.2.2 分組及建模 將所選取的60只大鼠隨機分為正常組、模型組、下調組、上調組各15只，模型組、下調組、上調組大鼠參照房茂勝等[3]研究中精神分裂癥模型的建立方法構建精神分裂癥大鼠模型，取MK801，在使用前先稀釋為0.1 g·L-1的注射藥液，在恒溫狀態下水浴震蕩20 min，在每日9：00～10:00將0.3 μg·g-1的MK801注射于大鼠左或者右下側腹腔略靠近外科1/3處(左、右側每日交替)，連續注射1周。正常組注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 LPL慢病毒載體滴定 建模成功后在下調組大鼠海馬組織注射含10 μL LPL的下調質粒慢病毒懸液，上調組大鼠海馬組織注射含10 μL LPL的上調質粒慢病毒懸液。正常組、模型組大鼠注射等量生理鹽水。7 d后觀察大鼠變化。

1.2.4 LPL慢病毒載體滴定效率鑒定 在LPL慢病毒載體滴定完成7 d后隨機取各組中3只大鼠使用5%苯巴比妥做常規腹腔注射麻醉后處死，迅速取海馬組織，采用實時熒光定量PCR法檢測LPL慢病毒載體滴定效率，提取并鑒定海馬組織總RNA含量、純度，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，采用Primer 5.0軟件設計引物序列。以U6為內參照，LPL上游序列5’-AGCTGTGCCTGTGATTGTAGCATTC-3’，下游序列：5’-AACATGTGAGTAAGGCTGCCACTAG-3’；U6上游序列5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3’，下游序列5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.5 刻板行為評分 依照Sams Dodd和Hoffman標準[4]對各組大鼠進行刻板行為評分，10 min·次-1，觀察60 min，共6次，評分標準：0分：大鼠靜止不動，無活動或者幾乎不活動；1分：大鼠正常活動，偶爾有向前的運動；2分：大鼠活動并伴隨著反復向前探索現象；3分：大鼠活動并持續向前探索；4分：大鼠存在重復旋轉、抬頭、搖頭表現；5分：大鼠出現快速搖頭、轉圈或者頭的背腹運動。

1.2.6 共計失調評分 對各組大鼠進行共濟失調評分[5]，10 min·次-1，觀察60 min，共6次，評分標準：0分：大鼠協調運動；1分：大鼠存在輕度搖晃現象，搖擺運動，豎立不倒；2分：大鼠存在中度的不協調運動，偶爾跌倒；3分：大鼠無力支撐體重，爬行運動；4分：大鼠無運動，躺向一邊。

1.2.7 水迷宮試驗 采用水迷宮試驗評價大鼠平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置次數連續測量3次，取均值。

1.2.8 樣本采集 在各組大鼠上述操作完成后，使用5%苯巴比妥做常規腹腔注射麻醉后處死，立即取海馬組織，分為均勻3等份，其中1等份做組織切片行病理組織學觀察，另外兩份在液氮中保存用于后續指標檢測。

1.2.9 病理組織學觀察 取所制備的海馬組織，固定1 d后，使用酒精脫水、二甲苯透明處理后做常規石蠟包埋，做5 μm切片，做HE染色，樹膠封片后使用光學顯微鏡觀察大鼠海馬組織病理變化。

1.2.10 Glu-DA神經遞質系統指標檢測 取1等份液氮中所保存的海馬組織，采用分光光度計檢測海馬組織中NO活性和MDA含量。采用實時熒光定量PCR法檢測海馬組織中nNOS mRNA表達量；采用HPLC-ECD法測定海馬組織中DA和Glu水平。

1.2.11 海馬組織CREB/BDNF/TrkB信號通路蛋白表達量檢測 采用Western blot法檢測大鼠海馬組織CREB/BDNF/TrkB信號通路蛋白CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB表達量，取1等份液氮中所保存的海馬組織，將所制備的海馬組織做10 000×g離心處理10 min，提取上清液，BCA進行蛋白定量檢測，DAB顯色，定量分析蛋白表達情況，內參為GAPDH。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行處理。計量資料采用均數±標準差描述，多組間比較采用完全隨機設計方差分析，P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPL基因轉染效率鑒定

如表1所示，與正常組相比，模型組、下調組LPL基因表達量降低，上調組LPL基因表達量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 LPL基因轉染效率鑒定

2.2 各組大鼠刻板行為評分、共計失調評分、平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置次數比較

如表2所示，與正常組相比，模型組、下調組、上調組刻板行為評分、共計失調評分、平均逃避潛伏期升高，穿越原平臺位置次數降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、下調組相比，上調組刻板行為評分、共計失調評分、平均逃避潛伏期降低，穿越原平臺位置次數升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠刻板行為評分、共計失調評分、平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置次數比較

2.3 病理組織學觀察

如圖1所示，正常組大鼠海馬組織結構正常，海馬神經元細胞(箭頭處)正常；模型組大鼠海馬神經元變性，細胞核固縮(箭頭處)，神經元細胞層減少；下調組大鼠海馬神經元變性，存在較為明顯的細胞核固縮現象(箭頭處)，神經元細胞層明顯減少。上調組大鼠存在局灶性的神經元變性現象，少量細胞核固縮(箭頭處)，組織學正常。

圖1 病理組織學觀察(HE×400)Fig. 1 Histopathological observation (HE×400)

2.4 各組大鼠Glu-DA神經遞質系統指標比較

如表3所示，與正常組相比，模型組、下調組、上調組NO活性、MDA含量、nNOS mRNA、DA水平升高，Glu水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、下調組相比，上調組NO活性、MDA含量、nNOS mRNA、DA水平降低，Glu水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Glu-DA神經遞質系統指標比較

2.5 各組大鼠海馬組織中CREB/BDNF/TrkB信號通路蛋白表達量比較

如表4所示，與正常組相比，模型組、下調組、上調組的CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB蛋白表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、下調組相比，上調組的CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB蛋白表達量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織中CREB/BDNF/TrkB信號通路蛋白表達量比較

圖2 CREB/BDNF/TrkB信號通路蛋白表達WB圖 Fig. 2 WB graph of protein expression of CREB/BDNF/TrkB signaling pathway

3 討論

目前臨床上對于精神分裂癥的具體發病機制仍處于不斷研究中，尚不完全明確，認為此病的發生與神經細胞膜相關，神經細胞膜主要包括花生四烯酸、二十二碳六烯酸，在神經發育的過程中多不飽和脂肪酸水平降低可增強血清、腦組織中PLA2的活性，進而誘導精神分裂癥的發生。

LPL基因定位于染色體8p22上，其長度大約為36 000 bp，由9個內含子和10個外顯子所構成，在脊髓、大腦、外周神經中廣泛存在，當大腦損傷或者周圍神經阻滯供血被阻斷后LPL含量顯著升高，修復損傷的神經組織[6-8]。臨床表明精神分裂癥的發生與人染色體8p22區域相關，而LPL基因同樣定位于染色體8p22上，因此推測LPL基因與精神分裂癥可能相關。但目前臨床上對于LPL基因與精神分裂癥的關系研究較少，僅有邢洪源等[2]發現LPL基因mRNA在精神分裂癥模型大鼠腦組織中的低表達。基于此背景，本文推測LPL基因可能作為精神分裂癥的靶點。上調和下調LPL基因對精神分裂癥動物模型的影響試驗結果顯示，LPL基因與精神分裂癥相關，上調LPL基因可阻止海馬組織進一步受損，抑制疾病進展。

CREB/BDNF/TrkB信號通路與神經系統發育相關，維持神經系統功能，其中BDNF屬于一種較為重要的腦源性神經營養因子，其在神經元生長分化、突出可塑性、抗神經元凋亡等過程中具有重要的意義[9]。而CREB屬于BNDF的上游轉錄因子，其具有對多種記憶相關蛋白表達的調節功能，其自身及磷酸化后均會在一定程度上抑制BDNF表達，促進BDNF下游調控因子TrkB磷酸化[10]。Guo等[11]在其研究中發現，上調CREB/BDNF/TrkB信號通路可改善精神分裂癥認知障礙。神經遞質系統紊亂與精神分裂癥發生后的海馬神經元損失相關，Glu-DA神經遞質系統在精神分裂癥發生后出現明顯的紊亂表現[12]。本文結果顯示，上調LPL基因可能經激活CREB/BDNF/TrkB信號通路，穩定Glu-DA神經遞質系統，發揮其改善精神分裂癥認知的作用。

綜上所述，本研究發現上調LPL基因后可在一定程度上修復精神分裂癥大鼠海馬組織損傷，其作用機制可能與激活CREB/BDNF/TrkB信號通路，穩定Glu-DA神經遞質系統，改善NO，MDA，nNOS，DA及Glu異常表達相關。但由于本研究動物樣本數量有限，該結論尚需后續試驗進一步證實。