奧希替尼治療大鼠脊髓損傷的時間窗研究

李在望, 武晶晶， 王 倩， 涂景梅， 韓 晶

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)在各國均有較高的發病率，常常導致嚴重的不可逆的功能缺損，例如肢體癱瘓、二便困難、性功能障礙等[1]。脊髓損傷后軸突不能有效再生是導致脊髓損傷患者遺留有嚴重殘疾的重要原因，因此如何促進損傷軸突的有效再生便成了治療脊髓損傷的關鍵[2]。SCI后，星形膠質細胞和小膠質細胞出現表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)的大量活化，這導致靜息的星形膠質細胞活化分泌大量的軸突再生抑制因子如硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)等，形成致密的膠質瘢痕而抑制軸突的有效再生[3,4]；而小膠質細胞活化后可釋放大量炎癥因子導致神經毒性炎癥損傷[5]。由此可見，SCI后EGFR活化導致的膠質細胞過度活化對軸突再生微環境起著不利的作用[3～5]。

但是另一方面，在SCI后的早期，活化膠質細胞形成的膠質瘢痕可以抑制病灶處的不良病理因素向正常組織擴散，對促進損傷軸突再生可能是有益的[6]。而活化的星形膠質細胞也可通過分泌膠質細胞源性神經生長因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)促進神經修復[7]。同時，活化的小膠質細胞可吞噬細胞碎屑和潰變的髓鞘，這對促進神經元修復同樣可能是有益的[8]。由此可見，早期的星形膠質細胞和小膠質細胞活化增生對軸突的修復可能有一定的積極作用[6,8]。因此，在SCI后何時干預膠質細胞活化以最大程度的發揮其保護作用并盡可能抑制其損傷作用便是干預SCI的一個關鍵問題。

目前已有研究證實，EGFR抑制劑可以通過抑制EGFR活化而對脊髓損傷后小膠質細胞的活化和星形膠質細胞反應性膠質增生產生抑制作用而促進了神經功能的恢復[4,9]。但SCI后，何時啟動EGFR抑制劑干預一直存在較大爭議。奧希替尼是第三代EGFR抑制劑，能透過血腦屏障而作用于中樞神經細胞[10]，而且給藥方便，故本研究以奧希替尼為干預藥物。本實驗擬通過在不同時間點應用奧希替尼對脊髓損傷進行干預，確定EGFR抑制劑奧希替尼干預SCI的最佳時間窗。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:健康成年雌性SD大鼠(200 g～250 g)60只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(實驗動物合格證號201822084);(2)主要試劑與材料：奧希替尼(購于Med Chem Express公司)，兔抗growth-associated protein 43(GAP-43)(購于Invitrogen公司)，鼠抗glyceraldehyde phosphate dehydrogenase(GAPDH)(購于英國Abcam公司)。

1.2 奧希替尼溶液的配制 奧希替尼(osimertinib)粉末溶于生理鹽水中，調配濃度為0.4 mg/ml。

1.3 大鼠脊髓損傷模型的制備及分組 200 g～250 g SD雌性大鼠60只，按隨機數字表法將大鼠隨機分為6組(n=10)：損傷對照組(injury組)、5個不同干預時間點的奧希替尼治療組(0 d組、1 d組、3 d組、5 d組7 d組)。應用標準打擊器制作大鼠脊髓損傷模型。選擇T10應用龍膽紫做標記，碘伏消毒鋪無菌巾后行背部正中切口，逐層分離肌肉，切斷T9-T11棘突上的韌帶及部分肌肉，充分暴露T9-T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜，應用打擊器的鉗夾系統固定T9、T11棘突，調整好打擊棒的高度(打擊棒重量為10 g，其打擊頭部直徑為2 mm，其打擊高度為1.25 cm，下落打擊致傷能量為25 gcf)，使打擊棒與T10段脊髓垂直，按下打擊開關，打擊棒垂直自由落下，打在硬脊膜表面，致傷后迅速移去打擊棒，可見打擊處硬脊膜迅速形成血腫，雙下肢痙攣抖動，尾巴痙攣性擺動，視為造模成功。各組行肌肉和皮膚縫合。消毒、復溫后將大鼠放回籠中。奧希替尼組按照組別分別在相應時間點給予奧希替尼溶液灌胃(2 ml/d)，對照組給予生理鹽水灌胃(2 ml/d)，給藥時長為SCI后2 w。

1.4 后肢運動功能評估 在脊髓損傷后第1天、第1周、第2周、第3周、第4周固定時間點觀察各組大鼠行為學的改變。應用BBB評分量表評定大鼠脊髓損傷后神經功能缺損的情況，最小值為0分，表示未觀察到后肢運動，最大值為21分為觀察到后肢運動功能完全正常[11]。兩人雙盲獨立觀察記錄評分結果，以防止主觀因素的干擾。

1.5 殘余尿量統計 大鼠脊髓損傷后，每天人工按摩腹部促進膀胱排尿兩次，并應用帶有刻度的小燒杯記錄殘余尿量以評估排尿功能。

1.6 脊髓GAP-43蛋白測定 各組大鼠(每組5只)于傷后14 d時深度麻醉后處死，快速剝取損傷節段脊髓組織，加人裂解液冰上孵育并徹底勻漿，離心后留取上清，BCA(bicinchonininc acid)法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；全濕式電轉法轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%封閉液(1 g奶粉+20 ml含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶，即TBST溶液)封閉2 h，分別加入一抗(兔抗GAP43，1∶500稀釋)；內參為GAPDH，4 ℃孵育過夜。用TBST溶液洗滌10 min×3次；加入二抗(HRP標記羊抗兔IgG，1∶1000稀 釋)，4 ℃過夜；TBST洗膜10 min×3次，加ECL發光顯示液在暗室中攝像，凝膠成像分析系統進行分析。

1.7 統計學分析 實驗數據采用SPSS 22.0、Graphpad 6.01等軟件進行分析、制圖。BBB評分及殘余尿量以重復測量方差分析進行統計學分析，GAP-43應用單因素方差分析，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同時間點奧希替尼干預后運動功能評分分析 通過在不同時間點應用奧希替尼(EGFR抑制劑)干預脊髓損傷，并連續動態(每周)觀察記錄大鼠后肢運動功能評分(BBB評分)，以分析干預脊髓損傷最佳開始時間。研究結果顯示：0 d組、1 d組及3 d組后肢運動功能評分接近，3組間評分無差異(P>0.05);而0 d組、1 d組及3 d組3組的評分均明顯優于5 d組、7 d組及對照損傷組(P<0.05)。5 d組及7 d組這兩組后肢功能評分與損傷組無明顯差異(P>0.05);而5 d組、7 d組和損傷組間大鼠后肢功能恢復無明顯差異(P>0.05)(見圖1、見表1)。由此可見，在SCI后0～3 d應用EGFR抑制劑奧希替尼干預可獲得最佳運動功能治療效果。

2.2 不同時間點奧希替尼干預后殘余尿量分析 本研究應用殘余尿量評估各組大鼠的排尿功能。其中，0 d組、1 d組及3 d組的殘余尿量分別較5 d組、7 d組及損傷組明顯減少，重復測量方差分析提示差異有統計學意義(P<0.05);而0 d組、1 d組及3 d組3組間殘余尿量很接近(P>0.05)。5 d組及7 d組這兩組殘余尿量均與損傷組無明顯差異(P>0.05)；而5 d及7 d兩組間殘余尿量無明顯差異(P>0.05)(見圖2、見表2)。研究結果提示：在SCI后急性期(0～3 d)，應用EGFR抑制劑奧希替尼進行干預是促進排尿功能恢復的最佳時機。

2.3 不同時間點奧希替尼干預后GAP-43蛋白表達量分析 由于GAP-43表達增加與軸突生長和再生密切相關，因此，GAP-43成為神經再生的常用指標[12]。在本研究中，0 d組、1 d組及3 d組GAP-43的表達不僅高于5 d組及7 d組(P<0.05),而且明顯高于損傷組(P<0.01);而0 d組、1 d組及3 d組3組間GAP-43表達無差異(P<0.05)(見圖3)。這一結果表明：在SCI急性期(0～3 d)應用奧希替尼干預后軸突再生相關蛋白GAP-43表達水平最高。

表1 各組大鼠各時間點的BBB評分比較

表2 各組大鼠各時間點的殘余尿量比較

圖1 在不同時間點應用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預脊髓損傷，觀察分組大鼠后運動功能恢復的差異。應用重復測量方差分析結果顯示：0 d組、1 d組及3 d組這3組后肢功能評分均明顯高于其他各組(P<0.05)

圖2 在不同時間點應用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預脊髓損傷，比較各組大鼠殘余尿量的差異。應用重復測量方差分析結果顯示：0 d組、1 d組及3 d組這3組殘余尿量均明顯少于其他各組(P<0.05)

圖3 在不同時間點應用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預脊髓損傷，比較各組大鼠SCI后14 d軸突再生相關蛋白GAP表達的差異。A圖為各組GAP-43的Western blot的典型條帶及GAPDH的條帶；B圖為各組GAP-43相對表達量分析條圖*P<0.05，#P<0.01

3 討 論

脊髓損傷后的神經功能缺損由原發性損傷和繼發性損傷兩種機制所致，而繼發性損傷與SCI后過度膠質增生引發的反應性神經毒性炎癥損傷密切相關[13]。機械暴力作用導致微血管內皮損傷，引發血脊髓屏障(BSCB)破壞，外周炎癥細胞和炎癥因子侵入脊髓神經組織。外傷和炎癥因子的雙重作用引發小膠質細胞和星形膠質細胞活化增生[14]。在損傷后的炎癥微環境中，這兩種膠質細胞相互應答，引發炎癥反應升級[15]。這不僅導致神經元脫失和髓鞘破壞，還導致非損傷區的BSCB破壞，從而引起新一輪外周炎癥細胞和炎癥因子侵入脊髓組織，形成脊髓組織炎癥損傷的惡性循環(即正反饋損傷)[1,8,16]。因此，阻斷這種炎癥損傷的惡性循環是干預SCI的關鍵策略。而SCI后星形膠質細胞和小膠質細胞出現過度活化增生是炎癥損傷的一個核心環節。SCI后導致膠質細胞活化增生的機制尚未完全明確，但目前實驗已證實，SCI后小膠質細胞和星形膠質細胞均出現表皮生長因子受體(EGFR)的活化[3,4,9]。EGFR是位于細胞質膜上的受體型酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase，TPK)，在細胞存活、生長、分化、增生等信號轉導通路中，起著關鍵性調節作用[17]。EGFR信號通路是調節中樞神經系統病變后膠質細胞活化增生的特異性轉導信號通路[18]。

奧希替尼是第三代EGFR抑制劑，可透過血腦屏障，能有效抑制EGFR的活化[10]。在本實驗中，我們選擇奧希替尼作為干預SCI后過度膠質增生的藥物。研究結果顯示在SCI的急性期(0～3 d)給予奧希替尼進行干預，大鼠的運動功能及排尿功能恢復最佳，而且軸突再生相關蛋白GAP-43的表達也是最高的。研究結果表明應用EGFR抑制劑奧希替尼干預SCI應選擇在SCI的損傷早期進行。

盡管有研究者認為在SCI早期星形膠質細胞和小膠質細胞的活化可能對損傷修復起一定的保護作用[15]，但SCI后膠質細胞的過度活化可引起的炎癥級聯反應產生反應性毒性神經炎癥損傷，同時還可引發病灶周圍正常脊髓組織的血脊髓屏障的破壞，導致炎癥進一步擴展，形成惡性循環[8,16]。因此，及時阻斷這種惡性炎癥損傷的級聯反應對減輕脊髓繼發性損傷有著及其重要的意義。本研究結果提示SCI后盡早(前3 d)應用EGFR抑制劑進行干預才能獲得最佳治療效果，這與其它EGGR抑制劑干預中樞神經損傷的時機選擇是一致的[3,4,9,19]。

總之，本實驗通過在不同時間點應用EGFR抑制劑奧希替尼對脊髓損傷進行干預，觀察SCI后大鼠運動功能及排尿功能恢復情況，并分析各時間點給藥后軸突再生相關蛋白GAP-43的表達情況，研究結果顯示：EGFR抑制劑奧希替尼干預脊髓損傷的最佳時間窗在SCI的急性期(0～3 d)。