基因突變與α-突觸核蛋白在帕金森病的研究進展

胡春波， 楊 穎， 孫江萌綜述， 沈麗華審校

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前世界第二大神經退行性疾病。PD是由黑質致密部的多巴胺能神經元大量丟失和α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)聚集形成路易小體(Lewy Body,LBS)和路易神經纖維(Lewy Neurites)為特征的病變[1]。Spillantini等人于1997年發現α-syn淀粉樣纖維是導致PD發生的毒性物質；最近的研究證實，α-syn在聚集初始階段形成有毒性的寡聚體是導致PD細胞死亡的神經毒性物質[2]，提示α-syn在疾病的發生和發展中起著重要的作用。目前已發現的與PD發病相關的基因有20多個(見表1)。SNCA、LRRK2和VPS35的常染色體顯性突變和PINK1、DJ-1和Parkin的常染色體隱性突變導致PD具有高外顯性。表中所示各基因在細胞內的定位及功能不同，如parkin、PINK1、DJ-1存在線粒體，參與線粒體相關的應激反應,突變會導致受損的線粒體清除障礙，進而導致α-syn的聚集[3]；LRRK2的存在與溶酶體、內溶酶體及自噬途徑相關，LRRK2突變增加了α-syn聚集[4]；VPS35介導囊泡的運輸，其異常突變，增加α-syn錯誤折疊和毒性[5]。表2列出了這幾個基因與PD相關的突變。我們將對以上SNCA、PRKN、PINK1、DJ-1、LRRK2和VPS35基因與α-syn的關系以及相互作用機制的最新進展作相關綜述。

1 α-syn的結構和致病機制

1.1 α-syn的結構 SNCA基因編碼的α-syn是一種14 kDa的蛋白分子，可分為3個主要區域：兩親水性的N-末端(1-60)、疏水性中心非淀粉樣成分(61-95)和酸性C-末端(96-140)。N-端是由 7個重復的 11個賴氨酸殘基組成的區域，形成兩個α-螺旋、3個轉角，目前所有已知的與α-syn相關的病理性突變均發生在該區域[6]，該區域可能還在突觸小泡運輸過程起作用[2]。其次，α-syn的C-末端結構域由許多帶電荷的氨基酸殘基組成的酸性不規則卷曲結構，該區域包含大多數翻譯后修飾位點，還介導α-syn與其他蛋白質、配體和金屬離子的相互作用。而中心區域非淀粉樣成分，形成核心，這個區域是淀粉樣的，負責蛋白質聚集。α-syn存在一個天然的未經折疊的三級結構，并且α-syn呈α-螺旋折疊的四聚體結構是天然構象，未折疊的單體是α-syn在腦中主要的生理存在形式。可溶性寡聚體(原纖維)是由兩個或以上的α-syn單體的聚集形成的，是纖維和包涵體形式的中間體，最初蛋白的錯誤折疊，經過多級反應過程后，導致寡聚體的形成并進一步形成纖維和包涵體。α-syn亞型在PD中也有不同的表達，異構體α-syn-98聚集體被注射到小鼠黑質后，可顯著提高內源性α-syn的磷酸化水平，α-syn的積聚與泛素結合蛋白p62和泛素共定位，其病理表現出與人Lewy Body相似的特性[7]。

1.2 α-syn致病機制 目前多數人認為PD的患病可能與基因突變導致的α-syn的自身聚集以及聚集早期形成的寡聚體有關[8]。1997 年Polymeropoulos等人發現α-syn首個突變A53T，為α-syn第 53 位氨基酸由丙氨酸變為蘇氨酸，會導致編碼的α-syn由原先α-螺旋結構變成新的β-片層結構，導致其降解障礙，α-syn發生聚集。另外，A30P則是α-syn第 30 位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸,以及E46K、A53E突變都會導致α-syn的錯誤折疊。而G51D突變是唯一一個導致α-syn聚集風險降低的。目前α-syn導致PD的機制尚不完全清楚，α-syn寡聚體和纖維哪一個毒性更大仍需要研究。2011年Winner等人，通過上調體內寡聚體，發現其對細胞和線粒體的毒性較上調纖維的毒性更大[2]。據報道，異常聚集的α-syn可能存在于線粒體內，也可能位于線粒體外膜影響其結構和功能[9]，具有許多不同的致病作用，包括細胞骨架改變；膜通透性(線粒體、內質網、囊泡)；增加Ca2+內流；增加活性氧(Reactive Oxidative Species,ROS)的產生；以及突觸毒性，表現為神經元興奮性降低和突觸放電減少[10]。寡聚體還損害自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體系統，已經報道了不同寡聚體的不同毒性機制，其中一些破壞了脂質雙層，細胞通透性增加，從而導致離子內流增加；而另一些則直接進入細胞并導致蛋白質聚集增加[10]。

2 Parkin和PINK1基因突變與α-syn三者通過影響線粒體自噬導致線粒體應激反應

Parkin基因，定位于染色體6q25.2-q27，含有12個外顯子，編碼的Parkin蛋白含465個氨基酸。目前發現Parkin基因突變會導致其功能喪失(見表2)，不能正常降解底物。Parkin敲除小鼠早期多巴胺能神經退行性病變和運動缺陷的發生被促進，但并未使病理惡化[11]。PINK1基因，定位于染色體1p36，包含8個外顯子，全長1.8 kb，編碼的PTEN誘導激酶1，位于線粒體膜上，與Parkin基因編碼的E3泛素連接酶共同作用線粒體，參與線粒體自噬[12]。在 2008 年的一項研究中，觀察到解偶聯劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)處理后，大量Parkin從胞漿移位到受損的線粒體，通過磷酸化激活Parkin，線粒體隨后通過自噬方式去除。最近，在Parkin基因敲除小鼠中也發現在其DA神經元中，線粒體破碎，內部結構異常積累[13]。Parkin介導的受損線粒體清除途徑需要PINK1，涉及Parkin-α-syn相互作用和泛素化，這些發現將這3個關鍵的PD基因與線粒體應激反應中的線粒體結構異常聯系起來。在PD患者中，α-syn過表達會引起線粒體復合體I活性下降和ROS生成增加，導致線粒體應激。線粒體損傷時的膜電位(ΔΨm)減少，導致PINK1通過線粒體膜外的自動磷酸化積累和激活，該磷酸化位點在哺乳動物細胞的研究表明，PINK1可以在殘基S228和S402處自動磷酸化，而在果蠅中S346殘基上是唯一的PINK1自動磷酸化位點[14]。磷酸化之后可進一步阻止依賴ΔΨm的PINK1進入線粒體內部隔室，而此時，Parkin會迅速移位到線粒體，通過PINK1和Parkin泛素化調節線粒體自噬介導的線粒體消除作用，清除受損的線粒體[15]。PINK1還能通過誘導自噬作用將α-syn降解[3]。然而，慢性線粒體應激或Parkin或PINK1基因突變引起的α-syn的長時間或者無節制激活會導致線粒體過度分裂、線粒體功能衰竭，最終導致神經細胞死亡和PD。α-syn、PINK1和Parkin三者共同作用于線粒體上，揭示了這些基因在線粒體的應激反應中的功能，在未來α-syn的特定功能進一步被研究，能對PINK1/Parkin和PD方面的研究進一步加深。

表1 PD相關基因的位置功能及發病年齡

表2 PD相關基因的變異類型

3 DJ-1基因突變通過影響溶酶體自噬導致α-syn降解異常

DJ-1基因定位于染色體1p36.23，含7個外顯子，編碼DJ-1蛋白，是含189個氨基酸的蛋白多肽鏈。早在2003年Bonifati等人，已經確認DJ-1(Park7)基因為早發性常染色體隱性遺傳性PD。目前證實，DJ-1基因與PD相關的致病突變主要有9個(見表2)。DJ-1蛋白是一種20 kDa的具有多種功能的小蛋白，參與多種細胞過程，如抗氧化應激、伴侶功能、轉錄調節、蛋白酶活性和線粒體調節等[4]。由于其廣泛的功能，目前很難闡明它是如何與α-syn相互作用，以及如何介導多巴胺能神經元變性導致PD。最近的研究證實， DJ-1與α-syn相互作用，影響病理性α-syn的聚集過程，部分氧化的DJ-1具有一個粘附表面，它隔離了α-syn單體，阻斷了α-syn聚集的早期階段，也限制了α-syn纖維的伸長。DJ-1將成熟的α-syn纖維改造成異構體的有毒寡聚體，使其能夠更好的被清除，減輕其毒性作用[16]。此外，DJ-1缺乏通過加速溶酶體2A 型相關膜蛋白(LAMP2A)的降解，而溶酶體LAMP2A水平是伴侶介導的自噬(CMA)調節的主要靶點。當DJ-1缺乏時，CMA功能相應缺乏，導致α-syn的積累而發生PD[4]，這與先前Chenere等人的結論相反，他們在體內實驗得到DJ-1沒有直接調節α-syn的功能，也沒有保護致病性α-syn的有害作用[17]。另外，Parkin、PINK1和DJ-1基因突變已被證明能夠引起多巴胺和Ca2+穩態的破壞，導致多巴胺氧化醌的形成、線粒體功能障礙和相關的氧化應激[18]。這些條件觸發了α-syn聚集，隨后惡性循環使神經元死亡。

4 LRRK2基因突變導致多種結構異常影響α-syn降解

LRRK2基因位于染色體12q12，含51個外顯子，全長144 kb。LRRK2基因突變與常染色體顯性遺傳和特發性PD相關。LRRK2編碼一個大的(2527個氨基酸)多結構域蛋白(富含亮氨酸重復蛋白2，LRRK2)。LRRK2除了有激酶結構域(kinase)外，還具有第二個酶性GTPase結構域(ROC/COR結構域)[19]。近期研究LRRK2至少有8個致病的突變與PD相關，4個在GTPase/ROC結構域(N1437H和R1441C/G/H)，3個在激酶結構域(I2012T、G2019S和I2020T),一個在COR結構域(Y1669C)(見圖1)。突變之間存在差異，因為激酶結構域的突變直接增加了激酶活性，而ROC-COR結構域的突變則降低了GTPase的活性。其中G2019S突變最頻繁，其次是R1441C/G/H。G2019S LRRK2促進了黑質多巴胺能神經元的α-突觸核病和變性已被廣泛報道[20,21]。LRRK2參與了許多細胞功能和途徑，包括囊泡運輸、細胞骨架動力學、神經遞質釋放、突觸可塑性、高爾基體和線粒體功能以及免疫反應[19]。除此之外，LRRK2在自噬中的作用也得到證實[22]。LRRK2的這一作用，可能是LRRK2位于GTPases效應結合基序中心的一個高度保守的位點上，通過磷酸化Rab蛋白的一個亞群導致其功能喪失，包括Rab8A、Rab10和Rab12。Rab蛋白是膜運輸、協調囊泡形成、囊泡沿肌動蛋白和微管蛋白網絡運動以及膜對接和融合的主要調節因子，這些都是自噬和溶酶體生物學中的重要方面[23]，也是清除α-syn的重要途徑。另外，易受傷害的多巴胺神經元中的LRRK2激酶活性通過涉及α-syn和線粒體損傷的氧化應激機制異常增加，從而導致內溶酶體功能障礙和磷酸化α-syn的積累[24]。LRRK2突變通過以上幾種可能的機制促進PD。

圖1 LRRK2結構域與致病突變的線性模型

5 VPS35基因突變通過影響逆轉錄復合物作用導致α-syn聚集

VPS35基因位于染色體16q11.2 位點，含17個外顯子，編碼蛋白長29.6 kb空泡蛋白分選35(VPS35)。在2011年，Zimprich等人研究證實該基因突變與家族性PD有關，也是常見的散發性PD原因[25]。最近在3個奧地利家系的14 例具有PD患者的VPS35基因中發現了一個新的常染色體顯性遺傳性帕金森病突變(p.Asp620Asn)，也證實了p.Asp620Asn突變體是晚發性帕金森病的病因[26]。 VPS35與VPS29和VPS26a是逆轉錄復合物的組成部分，復合物的功能是與不同的分揀連接素相互作用，將貨物從內體中分揀出來，并且能夠協調將其中某些蛋白質運輸到反式高爾基體，逆轉錄復合物發生異常已經確定為與PD過程有關[27]。在動物PD模型中，VPS35和α-syn之間建立了直接聯系，在該模型中VPS35缺乏會導致a-syn積聚[28]。進一步的研究表明，VPS35缺陷的DA神經元或表達PD的D620N突變體的DA神經元受到損害，加速了LAMP2A的降解，導致CMA自噬障礙，使α-syn聚集[8]。VPS35 D620N突變體還能導致復合物Ⅰ和Ⅱ的酶活性降低和呼吸缺陷，其可能是D620N突變體導致患者成纖維細胞中的組裝復合物Ⅰ和Ⅱ以及超復合物的水平顯著降低，導致生物能量缺陷[29]。然而，不能排除是否為VPS35 D620N突變體通過影響α-syn聚集間接影響復合物Ⅰ的可能性。VPS35缺失或突變可能導致多個分子/細胞通路的缺陷，這些缺陷共同促進PD的發病。

6 總結與展望

綜上所述，無論是SNCA基因本身突變導致的異常α-syn聚集，還是parkin/PINK1和DJ-1突變與線粒體作用異常，以及LRRK2和VPS35異常突變導致自噬障礙，都能導致PD的發生。雖然他們在不同的途徑上作用，但都與一個中間物α-syn相聯系。雖然目前對α-syn及PD發生的相關機制仍需要進一步研究，但是，隨著今后人類對基因測序、基因識別等的進一步發展，將對上述基因與α-syn的相互作用有進一步的了解，為PD的診治提供更多的依據。