海馬p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體在老年小鼠術(shù)后認知障礙中的作用

高玉竹 ， 紀(jì)木火 ， 周志強

術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是麻醉手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1]，表現(xiàn)為記憶力、注意力、信息處理過程及認知靈活性下降等，尤多見于老年患者[2]。POCD嚴(yán)重影響其生活自理能力和生活質(zhì)量，顯著增加家庭與社會經(jīng)濟負擔(dān)[1,2]。然而，目前有關(guān)POCD的發(fā)病機制仍不清楚。p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)，是導(dǎo)致眾多神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)行為異常的關(guān)鍵因素[3]。

研究表明，p75NTR參與成年小鼠炎癥誘導(dǎo)的突觸損傷及認知障礙[4]，敲除p75NTR基因，可有顯著上調(diào)海馬神經(jīng)元突觸密度并改善小鼠認知功能[5,6]。然而，有關(guān)p75NTR信號通路在POCD中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討海馬p75NTR在POCD中的作用及機制，為POCD的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 老年雄性C57BL/6小鼠(18～20月齡)30只，購置于常州卡文斯實驗動物有限公司。采用隨機數(shù)字法分為3組：對照組、手術(shù)組及手術(shù)+TAT(TAT-Pep5-Calbiochem，p75NTR抑制劑)組，每組10只。手術(shù)后第6天行條件性恐懼實驗，第7天行場景性條件性恐懼實驗。行為學(xué)訓(xùn)練之前30 min腹腔注射TAT(3 mg/kg；506181，Sigma)或等容量生理鹽水。

1.2 POCD模型建立 將手術(shù)組小鼠置于透明半封閉呼吸環(huán)路麻醉箱中，箱外配有含二氧化碳吸附劑的回收裝置。小鼠放入麻醉箱內(nèi)前預(yù)充1.5%異氟醚+100% O2。待小鼠翻正反射消失后，取右側(cè)臥位，保持呼吸道通暢，謹(jǐn)防誤吸，維持麻醉30 min。麻醉箱中氣體濃度由Vamos持續(xù)監(jiān)測多參數(shù)麻醉氣體監(jiān)護儀進行連續(xù)監(jiān)測。手術(shù)組小鼠在麻醉后迅速移至手術(shù)臺，紅霉素眼藥膏涂抹眼部，將圓錐形面罩固定在小鼠口鼻部。用70%酒精消毒腹部，剪去腹部毛發(fā)，70%酒精再次消毒后取腹正中約1.5 cm切口。按順時針方向，依次緩慢探查腸道、肝、脾、腎等腹膜腔臟器，隨后將約3 cm的部分腸道輕輕外露并用拇指和食指輕輕摩擦約30 s，然后將其放回原腹膜腔，保證腸道的方向不發(fā)生轉(zhuǎn)變，總探查時間約10 min。探查結(jié)束后用無菌絲線縫合肌肉筋膜及皮膚，術(shù)后傷口涂抹硫鏈絲霉素預(yù)防感染。皮下注射溫生理鹽水30 ml/kg，補充術(shù)中液體丟失;術(shù)后將小鼠放入通有100% O2的籠中，保溫處理直至小鼠意識完全恢復(fù)。手術(shù)+TAT組小鼠手術(shù)操作同手術(shù)組，并在行為學(xué)訓(xùn)練30 min前給予腹腔注射p75NTR抑制劑TAT(3 mg/kg)。對照組小鼠除持續(xù)吸入相同時間100% O2外不進行任何處理。

1.3 曠場實驗 術(shù)后第5天行曠場試驗測試，曠場實驗是用來評估動物的探索行為和焦慮行為。將實驗小鼠置于40 cm×40 cm×40 cm的敞箱中心，自由探索5 min。使用自動監(jiān)視系統(tǒng)(XR-XC404；上海欣軟信息技術(shù)有限公司，上海)記錄并分析中央格停留時間和活動總距離。在每次測試結(jié)束時，用75%的酒精進行礦場清潔，以消除氣味干擾，充分晾干后繼續(xù)實驗。

1.4 條件性和場景性恐懼實驗 本實驗分為訓(xùn)練和測試階段。術(shù)后第6天行條件性和場景性恐懼實驗訓(xùn)練，將小鼠置于實驗箱(32 cm×32 cm×45 cm)適應(yīng)3 min后，給予30 s單頻聲音刺激(1 kHZ,80 dB,CS)，然后給予2 s足底電擊(1 mA，US)。24 h后將小鼠再次放入同一實驗箱中，在不給予任何刺激情況下進行場景測試以評估僵直行為，記錄小鼠5 min內(nèi)的僵直(除呼吸運動外無其他任何行為活動的不動狀態(tài))時間。場景性恐懼實驗結(jié)束2 h后，改變環(huán)境(實驗箱底部放入分隔板，四壁粘貼不同形狀、顏色塑料板等)，在新場景中測試線索恐懼記憶，行條件性恐懼測試。給予小鼠連續(xù)3 min和訓(xùn)練時相同的聲音刺激(180 s，70 dB，3000 Hz)，同時記錄3 min內(nèi)小鼠的僵直時間。使用自動監(jiān)視系統(tǒng)(XR-XC404；上海欣軟信息技術(shù)有限公司，上海)記錄并分析。通過監(jiān)測小鼠僵直行為時間來評估認知功能障礙，在每次測試結(jié)束時，用75%的酒精進行礦場清潔，以消除氣味干擾，充分晾干后繼續(xù)實驗。

1.5 Western blot檢測 行為學(xué)結(jié)束后2 h,每組隨機選擇4只小鼠斷頸處死，置于冰上取雙側(cè)新鮮海馬組織。將海馬標(biāo)本置于添加蛋白酶抑制劑的低溫裂解緩沖液中進行裂解，研磨組織，4 ℃離心(12000 r/min，10 min)取上清液。提取上清液后，使用Braford法定量蛋白濃度， 95 ℃煮5 min，使蛋白變性。電泳轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。加入一抗4 ℃過夜，次日TBST漂洗10 min×3次;二抗室溫孵育2 h并漂洗3次，底物顯色反應(yīng)、曝光顯影。采用Image J軟件檢測海馬p75NTR、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、原肌球蛋白受體B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)、環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)含量。一抗二抗貨號下：p75NTR(55014-1-AP)、BDNF(ab108319)、PSD95(ab238135)、TrkB(ab187041)、pCREB(MABN1194)、GAPDH(60004-1-Ig)及二抗 (A0208、A0216)。

1.6 免疫熒光 采用免疫熒光技術(shù)比較CA1、CA3及DG區(qū)caspase-3陽性細胞數(shù)的變化。小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，經(jīng)心灌注生理鹽水，然后用4%多聚甲醛溶液灌注后取腦。4 ℃溫度下30%蔗糖溶液中脫水過夜，OCT包埋后使用低溫保持器將其切割成30 μm厚的切片。切片在室溫下用5%小牛血清白蛋白封閉1 h，擦干后加一抗(caspase-3，AB3623,Millipore，1∶500)，4 ℃過夜。用PBS洗滌3次后，加帶熒光標(biāo)記的二抗。二抗洗凈后，使用含DAPI的抗熒光萃滅封片劑進行封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image J測量各切片的免疫熒光均值。

1.7 高爾基染色 采用FD快速高爾基染色試劑盒進行高爾基染色。行為學(xué)結(jié)束后2 h,每組隨機選擇3只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，麻醉后斷頭取全腦，沖凈大腦表面的血漬后，將大腦浸泡在浸漬液(10 ml溶液A+10 ml溶液B等體積混合)中，24 h后更換一次新的AB液后，室溫避光保存24 d；隨后轉(zhuǎn)移至溶液C(15 ml)中浸泡，24 h后更換一次新的溶液C，室溫避光保存 7 d。使用冰凍切片機切片，厚度為100 μm。室溫晾干；PBS洗滌2×4 min。將腦片置于混合液(5 ml溶液D+5 ml溶液E+10 ml 雙蒸水)中浸泡10 min。miliQ 水洗滌2×4 min。腦片復(fù)染(硫堇)，PBS洗滌2×4 min。先后分別使用50%、75%和 95%乙醇對腦片進行梯度脫水一次，每次4 min。隨后，無水乙醇脫水4×4 min，二甲苯透明3×4 min，中性樹膠封片劑封片，通風(fēng)櫥晾干。Olympus(物鏡20×和100×)拍攝海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘。使用 Image J 圖像分析軟件、Neuro J插件分析小鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1 P75NTR含量 免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組比較，手術(shù)組動物海馬P75NTR表達水平顯著增高(P<0.05)(見圖1)。

2.2 行為學(xué)變化 曠場實驗中，各組動物在總探索路程、中央格停留時間無顯著差異(P>0.05)。與對照組比較，手術(shù)組動物場景僵直時間均顯著降低(P<0.05)，手術(shù)+TAT組場景僵直時間較手術(shù)組而言顯著增加(P<0.05)。3組實驗小鼠條件性恐懼實驗中聲音僵直時間比較均無差異(P>0.05)(見表1)。

2.3 Caspase-3陽性細胞數(shù) 免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，手術(shù)組小鼠海馬各區(qū)caspase-3陽性細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；與手術(shù)組比較，手術(shù)+TAT組小鼠海馬各區(qū)caspase-3陽性細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

2.4 海馬BDNF、PSD95、TrkB、pCREB含量 與對照組比較,手術(shù)組動物海馬BDNF、PSD95、TrkB及pCREB表達顯著降低(P<0.05)；與手術(shù)組比較，手術(shù)+TAT組動物海馬BDNF、PSD95及pCREB表達顯著增加(P<0.05)(見圖3)。

2.5 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘 與對照組比較，手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目顯著降低(P<0.05)；與手術(shù)組比較，手術(shù)+TAT組小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目顯著增加(P<0.05)(見圖4)。

表1 曠場實驗及條件性恐懼實驗結(jié)果

與對照組比較aP<0.05

與對照組比較aP<0.05；與手術(shù)組比較bP<0.05，標(biāo)尺=100 μm

與對照組比較aP<0.05;與手術(shù)組比較bP<0.05

3 討 論

本實驗結(jié)果表明，手術(shù)可引起老年小鼠場景性恐懼實驗測試的僵直時間明顯降低，提示海馬依賴性恐懼記憶能力受損，表明POCD模型制備成功。此外，POCD老年鼠海馬p75NTR表達水平顯著上調(diào)，抑制p75NTR可使caspase-3陽性細胞數(shù)顯著降低，BDNF、PSD95、TrkB及pCREB表達顯著增加，同時海馬神經(jīng)元樹突棘密度也顯著增加，條件性恐懼實驗測試的僵直時間顯著增加。這些結(jié)果表明p75NTR在POCD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力受突觸可塑性調(diào)控，突觸功能異常與神經(jīng)退行性病變中的認知障礙的發(fā)生密切相關(guān)[7]。在神經(jīng)退行性病變中，p75NTR是調(diào)控神經(jīng)元凋亡、損傷突觸可塑性的重要因素[8]。研究表明p75NTR以低親和力與神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合，從而介導(dǎo)神經(jīng)元存活、分化和髓鞘形成[9]。近年研究表明：p75NTR與神經(jīng)營養(yǎng)素前體分子如腦源性生長因子前體以高親和力結(jié)合，導(dǎo)致c-Jun氨基末端激酶和caspases的激活，該通路參與神經(jīng)元凋亡[10]。p75NTR表達于海馬神經(jīng)元的細胞膜，是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，是由黑色素瘤細胞系A(chǔ)785中分離出來的跨膜神經(jīng)營養(yǎng)受體。在阿爾茲海默癥模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除p75NTR基因后，小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元樹突棘密度顯著增加，同時小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也顯著改善[6]。在另一項研究中，使用p75NTR抑制劑，可顯著改善老年小鼠在水迷宮實驗中的學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)[11]。本實驗結(jié)果與先前研究相似，POCD老年小鼠海馬內(nèi)p75NTR含量增加，海馬區(qū)caspase-3陽性細胞數(shù)增多，細胞凋亡進程亢進，同時伴有學(xué)習(xí)記憶能力受損。抑制p75NTR信號通路，POCD模型老年小鼠海馬區(qū)凋亡細胞減少，同時學(xué)習(xí)記憶能力改善。

記憶能力與突觸可塑性均受神經(jīng)營養(yǎng)因子及突觸相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)[12,13]。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，促進神經(jīng)元軸突和樹突生長及突觸的形成，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能。BDNF通過激活TrkB上調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，促進轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化，進而上調(diào)保護性蛋白，如BDNF、PSD95等基因的轉(zhuǎn)錄，促進神經(jīng)元發(fā)生[14]。PSD-95作為突觸后膜胞質(zhì)面細胞骨架網(wǎng)內(nèi)最主要的細胞骨架蛋白，是突觸后致密物大小和突觸強度的重要決定因素，在神經(jīng)元發(fā)育、長時程增強及認知功能中均非常必要，在突觸結(jié)構(gòu)、功能和可塑性等方面也發(fā)揮重要作用[15]。而p75NTR發(fā)揮與BDNF相反的神經(jīng)生物功能,p75NTR與proBDNF結(jié)合后促進神經(jīng)元凋亡，抑制突觸可塑性[16]。本研究中，可觀察到POCD老年小鼠海馬內(nèi)BDNF、TrkB、pCREB表達顯著下降，神經(jīng)保護因子分泌減少，促使神經(jīng)細胞功能障礙；同時伴有海馬內(nèi)PSD95的含量顯著下調(diào)，CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘數(shù)量減少，出現(xiàn)記憶功能損傷。使用p75NTR抑制劑后，小鼠海馬內(nèi)BDNF、TrkB、pCREB及PSD95含量顯著上調(diào)，同時改善小鼠的認知功能。這些結(jié)果表明，手術(shù)小鼠的記憶缺陷與神經(jīng)營養(yǎng)因子和突觸相關(guān)蛋白的表達失調(diào)有關(guān)，而抑制p75NTR可有效改善突觸可塑性。

綜上所述，P75NTR通過促進神經(jīng)凋亡等機制介導(dǎo)神經(jīng)元突觸功能異常，進而導(dǎo)致POCD發(fā)生。通過阻斷P75NTR途徑，可以有效改善POCD。然而，我們未深入探討p75NTR上調(diào)后通過何種機制影響神經(jīng)因子表達，這有待后續(xù)進一步深入的研究。