生物炭與炭基肥對大豆根際土壤細菌和真菌群落的影響

高文慧，郭宗昊，高科，薛晨，昌夢園，劉遠，王光利

淮北師范大學生命科學學院，安徽 淮北 235000

土壤微生物是土壤環境中的一個主要成分，是土壤生態平衡和養分物質循環的主要調控者，土壤微生物群落在農田土壤生態系統中起著重要作用（榮涵等，2020；嚴君等，2019）。生物炭，是由農作物秸稈等生物質在無氧或限氧的條件下經過熱裂解產生的一種固體顆粒物質，其具有較高的pH值、疏松多孔、含碳量較高、有機官能團豐富，穩定性強等特性，且隨原料和制作工藝的變化而有所差異（蔡曉青，2019；邵慧蕓等，2019；Chen et al.，2018；Sun et al.，2016）。由于熱解炭化后的生物炭為粉末狀，在運輸、施用以及儲存上都有一定的困難，且自身礦質養分含量低，生產上常將生物炭作為主要原料與一定比例的有機或無機肥料混合后造粒制成炭基肥（康日峰等，2014；魏春輝等，2016）。研究秸稈生物炭和炭基肥施用對土壤細菌和真菌群落的影響，評估其施用后對土壤質量的改良效果，可為秸稈資源合理利用和土壤培肥提供理論依據。

生物炭對農田土壤微生物群落的影響已受到人們的廣泛關注（陳坤等，2018；王穎等，2019）。大量研究表明，生物炭添加通過直接或間接作用影響土壤微生物的生長和代謝，進而改變微生物群落結構與豐度（陳懿等，2020；殷全玉等，2020）。與非根際相比，根際區域內營養較為豐富，植物細胞脫落物與根系分泌物為根際微生物提供豐富碳源等營養物質，此外，在外界環境的刺激下，可能會引起根際效應進而刺激微生物活動，導致土壤酶活性較高且微生物活動較為頻繁（程揚等，2018；劉京偉等，2020）。目前，相關研究更關注于非根際土，而且關于生物炭施加對根際土壤細菌和真菌群落的影響結果不一致。殷全玉等（2020）研究連續4年施用生物炭對非根際土微生物群落結構的影響，結果表明連續施用生物炭對細菌、真菌OTU數量和α-多樣性指數沒有顯著影響，但改變了土壤細菌、真菌的群落結構。邵慧蕓等（2019）關于小麥秸稈炭和煙桿炭兩種生物炭對烤煙根際微生物群落結構影響的研究結果顯示，與不添加生物炭處理相比，這兩種生物炭處理顯著降低了細菌和真菌的多樣性，同時也改變了細菌和真菌優勢種群的相對豐度。程揚等（2018）研究發現，與不施用生物炭相比，施加生物炭顯著提高了非根際土壤微生物群落多樣性，但對根際土壤微生物多樣性沒有影響。對竹子、水稻秸稈和糞便生物炭與化肥的配施研究表明，生物炭增加了玉米土壤細菌的多樣性，但是與僅施用生物炭處理相比，生物炭-肥料的相互作用降低了細菌多樣性，同時也改變了根際微生物的群落結構（Ibrahim et al.，2020）。以上研究表明，由于土壤類型、作物種類、種植方式和生物質炭原料不同，生物炭對土壤細菌和真菌群落影響結果的不盡一致（魏春輝等，2016；陳懿等，2020）。生物炭應用于作物生產，應該因作物類型、土壤類型和具體條件而異。

目前，有關生物炭添加對砂姜黑土微生物多樣性影響的研究較少，還需要開展更多試驗來探究生物炭添加對砂姜黑土細菌和真菌多樣性的短期效應及長期效應。本研究通過黃淮海平原豆-麥輪作田間定位試驗，采用生物炭不同施入量和增加生物炭緩施的施入方式，同時增加炭基肥處理，探究生物炭輸入下砂姜黑土大豆根際細菌和真菌群落豐度和群落結構的變化，以期為生物炭在農業生產上的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗設計

試驗地位于安徽省淮北市杜集區徐暨村（34°04′N，116°93′E），屬于典型的溫帶季風氣候，年平均溫度14.8 ℃，年平均降水量830 mm，年無霜期202 d。供試土壤為砂姜黑土，試驗開始前土壤pH值為 8.05，土壤有機碳為 11.35 g·kg?1，總氮為 0.98 g·kg?1，速效磷為 14.61 mg·kg?1，速效鉀為 120.29 mg·kg?1。生物炭和炭基肥購自南京勤豐秸稈科技有限公司，水稻秸稈炭的pH為10.07，有機碳為470.70 g·kg?1，總氮為 9.19 g·kg?1，全磷為 6.01 g·kg?1，全鉀為 19.12 g·kg?1，電導率為 139.75 μs·cm?1。

本試驗設 5個處理，分別是：單施化肥對照（CK），750 kg·hm?2復合肥；秸稈還田配施化肥（CS），秸稈全量還田+750 kg·hm?2復合肥處理；炭基肥處理（BCF），單施 750 kg·hm?2炭基肥；低量生物炭配施化肥處理（LB），5 t·hm?2生物炭緩施+750 kg·hm?2復合肥處理；高量生物炭配施化肥處理（HB），20 t·hm?2生物炭+750 kg·hm?2復合肥。每個小區面積為20 m2（4 m×5 m），每個處理3次重復，采用完全隨機區組設計。其中，施用復合肥中含有15% N、15% P2O5和15% K2O；炭基肥中含有15% N、15% P2O5、10% K2O和40%的有機養分。另外，炭基肥處理（BCF）在施肥時補充3.75 t·hm?2K2O，以使所有處理的氮磷鉀量相同。每個試驗小區均采用常規管理模式進行田間管理。

1.2 土壤樣品的采集

大豆的供試品種為“中黃37”，于2017年6月下旬播種，并于2017年10月在大豆成熟期進行土樣采集。隨機選取6—8株植株，采用抖根法收集根圍0—2 mm范圍內根際土壤樣品，將每個小區的土樣混合均勻，裝入干凈無菌自封袋帶回實驗室。將樣品分為3份：一份風干，用于土壤基本理化性質測定；一份放于 4 ℃冰箱，以供土壤總 DNA的提取；另一份放于?80 ℃冰箱冷凍保存以供后續分析。

1.3 土壤理化指標的測定

土壤pH、有機碳（Soil organic carbon，SOC）、總氮（Total nitrogen，TN）、速效磷（Available phosphorus，AP）和速效鉀（Available potassium，AK）的測定參照魯如坤（2000）的方法。土壤pH采用pH計按水土比為2.5∶1測定；土壤有機碳和總氮采用元素分析儀（Vario EL，德國）測定；土壤銨態氮和硝態氮用2 mol·L?1KCl浸提，用連續流動化學分析儀（AA3，德國）測定；土壤速效磷采用0.5 mol·L?1NaHCO3浸提-分光光度計法測定；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度計測定。

1.4 土壤總DNA的提取、擴增與高通量測序

使用土壤基因組 DNA試劑盒（PowerSoil?DNA Isolation Kit，MoBio Laboratories Inc.，CA）提取0.5 g土壤樣品的總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計（ND-1000，NanoDrop Technologies，USA）檢測DNA質量。

土壤細菌和真菌豐度采用實時熒光定量 PCR（qPCR）技術進行測定。細菌16S rRNA和真菌ITS區分別采用引物對 F338/R518和 5.8s/ITS1F進行qPCR擴增。qPCR擴增采用20 μL反應體系：10 μL 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix，10 μM 正反向引物各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，8 μL無菌超純水。每次擴增 qPCR產物通過 1%瓊脂糖凝膠電泳驗證qPCR產物的片段大小是否正確。本試驗的標準曲線質粒稀釋范圍從 10?1—10?8，r2值大于0.98。結果以每克干土含有的基因拷貝數表示。

土壤細菌和真菌的群落組成分析通過高通量測序進行，該測定由上海天昊生物科技有限公司完成。利用細菌 16S rRNA V4—V5區特征性引物515F/907R和真菌ITS1區引物ITSI/ITS2分別進行擴增，擴增產物用純化試劑盒進行純化并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量，并構建文庫。使用QIIME軟件進行序列拆分和質量控制，將有效序列按照 97%相似性進行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類分析，將得到的OTU代表序列比對分類。采用 Mothur軟件計算細菌和真菌的α-多樣性指數，包括Chao1指數、ACE指數和Shannon指數。

1.5 數據處理與分析

運用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan法進行顯著性檢驗（P＜0.05）；利用 Excel 2010軟件進行基礎數據的整理并用Origin 8.5軟件作圖；用Canoco 4.5軟件對土壤細菌、真菌群落相對豐度和基本理化性質作冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析相關關系。

2 結果與分析

2.1 施用生物炭和炭基肥對土壤理化性質的影響

由表1可知，與對照CK相比，BCF、LB和HB處理的pH、銨態氮和硝態氮含量無顯著變化。不同處理下土壤有機碳和速效磷含量均呈現增加趨勢。BCF、LB和HB處理的有機碳和速效磷含量顯著高于對照 CK，且隨著生物炭添加量的增加而增加；BCF、LB和HB處理的速效磷含量無顯著差異。總氮含量在CS、BCF和LB處理下沒有顯著變化，而在HB處理中比對照顯著提高，增幅達到8.9%。

表1 施用生物炭和炭基肥對土壤理化性質的影響Table 1 Effects of biochar and biochar compound fertilizer application on soil physiochemical properties

2.2 施用生物炭和炭基肥對土壤細菌和真菌豐度的影響

從圖1A可以看出，不同處理的細菌16S rRNA基因拷貝數為 3.01×1010—3.63×1010copies·g?1，不同處理間沒有顯著差異。從圖1B可以看出，不同處理的真菌 ITS基因拷貝數位于 2.72×108—5.07×108copies·g?1，HB 處理下真菌拷貝數顯著高于其他處理，CS、BCF、LB處理的真菌拷貝數與對照相比分別增加了30.5%、27.9%、25.0%，但均未達到顯著性差異水平。

圖1 不同處理細菌（A）和真菌（B）基因豐度Fig.1 Copy number of bacterial (A) and fungal (B) gene under different treatments

2.3 施用生物炭和炭基肥對土壤細菌和真菌多樣性的影響

通過高通量測序，細菌和真菌群落分析分別獲得1518197和2334861條有效序列，在相似水平為97%條件下，細菌和真菌 OTU數分別為 4455—4535和1142—1224，不同處理間沒有顯著差異（表2）。通過微生物群落α-多樣性指數，比較不同處理下土壤細菌和真菌群落物種均勻度和豐富度變化。如表2所示，細菌群落的Chao1指數、ACE指數和Shannon指數在不同處理間沒有顯著差異。真菌群落的Chao1指數和ACE指數隨著生物炭添加量的增加而增加，HB處理的真菌群落 Chao1指數和ACE指數顯著高于對照CK；而與對照CK相比，真菌群落的Shannon指數在BCF、LB和HB處理下沒有顯著差異。說明生物炭與炭基肥施用對土壤細菌均勻度和豐富度沒有影響，但是提高了真菌均勻度指數。

表2 不同處理細菌和真菌操作分類單元數（OTUs）和α-多樣性指數Table 2 Operational taxonomic units and alpha diversity index of bacterial and fungal community under different treatments

2.4 施用生物炭和炭基肥對土壤細菌和真菌群落組成的影響

如圖2A所示，大豆根際土壤細菌群落的優勢類群依次是變形菌門（Proteobacteria）31.57%—34.01%、擬桿菌門（Bacteroidetes）10.99%—16.11%、酸桿菌門（Acidobacteria）11.37%—13.15%、放線菌門（Actinobacteria）7.58%—8.92%和綠彎菌門（Chloroflexi）7.17%—7.82%。與CK相比，HB處理顯著降低了變形菌門的相對豐度，擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門相對豐度在不同處理間差異不顯著。

大豆根際土壤真菌群落的優勢類群依次是子囊菌門（Ascomycota）42.58%—56.25%、接合菌門（Zygomycota）13.18%—16.94%和擔子菌門（Basidiomycota）5.73%—16.26%（圖 2B）。與 CK相比，子囊菌門、接合菌門和擔子菌門相對豐度在不同處理間沒有顯著差異。

圖2 細菌（A）和真菌（B）在門水平上的組成分布Fig.2 Community composition of bacterial (A) and fungal (B) relative abundance at the phylum level

2.5 不同處理下微生物群落結構與土壤環境因子的關系分析

通過對不同處理土壤群落結構與土壤理化性質關系進行冗余分析，第一主軸和第二主軸解釋了細菌總變異量的68.3%（圖3A）。不同處理的樣品點沒有明顯分開，其中LB和HB處理與CK的樣品點在RDA2軸方向上分開一定距離，說明不同生物炭處理對細菌群落結構有一定程度的影響。另外，在所選的土壤環境因子中，與細菌群落結構相關性較大的因子為有機碳和總氮。

如圖3B所示，第一主軸和第二主軸分別解釋了真菌總變異量的37.8%、17.7%。CS處理與對照CK聚在一起，不同生物炭和炭基肥處理與CK在RDA1軸方向上明顯分開，而HB處理的樣本點單獨聚在一起，與CK處理距離更大，說明添加生物炭和炭基肥改變了真菌群落結構，且添加高量生物炭對真菌群落結構的影響更為顯著。此外，有機碳、總氮和速效鉀對真菌群落結構具有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 細菌（A）和真菌（B）群落結構與土壤性質間的冗余分析Fig.3 RDA analysis of bacterial (A) and fungal (B) community structure and soil physiochemical properties

3 討論

3.1 施用生物炭和炭基肥對大豆根際細菌群落的影響

生物炭和炭基肥添加到農田土壤后，可以通過改變土壤理化性質或者改變其他微生物種群的活性間接影響細菌群落（劉師豆等，2020）。Yao et al.（2017a）探究施用3年不同用量生物炭對東北黑土細菌群落組成的影響，結果表明生物炭處理顯著增加了細菌豐度和α-多樣性，尤其是在高劑量施加水平（8%）下，推測可能與土壤環境的變化有關，土壤pH作為影響細菌豐度的主要因素，試驗中土壤pH隨生物炭的添加顯著上升。Zheng et al.（2016）研究表明，生物炭施用4年后顯著提高了稻田土壤細菌的多樣性（Chao1、ACE和Shannon），其變化與土壤 pH、有機碳和總氮呈正相關。此外，侯建偉等（2018）通過室內培養試驗探究玉米、水稻和油菜秸稈生物炭對黃壤細菌群落的影響，結果指出不同來源秸稈生物炭的添加提高了細菌的豐度和多樣性，且提升幅度與生物炭的類型有關，表明生物炭可以通過影響土壤化學性質和微生物細胞間信號物質的傳遞等方式間接改變細菌群落。本研究結果表明，不同處理的細菌16S rRNA基因拷貝數較對照CK提高了7.3%—20.6%，但未達到顯著性差異水平（圖1A）。同時，與對照相比，生物炭的施用對細菌群落的OTU數量和α-多樣性（Chao1、ACE和Shannon）沒有顯著性影響（表2），這主要是與試驗年限和土壤pH有關，生物炭自身結構比較穩定，含有大量不易被分解利用的芳香烴類物質，對土壤細菌的影響是一個漫長的過程（Dong et al.，2017；Hammes et al.，2009）；此外，土壤 pH是調控細菌豐度和多樣性的關鍵因子，本試驗供試土壤呈堿性，添加生物炭對土壤pH沒有顯著影響（表1），這與Yao et al.（2017a）報道的土壤pH是影響細菌豐度主要因素的結果一致。

大量研究結果表明，不同微生物類別對生物炭處理所產生的響應存在差異（Yao et al.，2017a；陳澤斌等，2018）。土壤細菌群落組成（門水平）的分析顯示，大豆根際土壤優勢細菌為變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門（圖2A），這與黃土高原以及東北地區關于土壤細菌群落組成的研究結果相吻合（王穎等，2019）。進一步分析處理間的差異，結果表明，高量生物炭處理較對照顯著降低了變形菌門的相對豐度，這與陳澤斌等（2018）的研究結果類似，生物炭處理使煙草根際土壤變形菌門的相對豐度相較于不施用生物炭處理降低了0.7%—4.1%。變形菌門是細菌中最大的門類，包括大腸桿菌、沙門氏菌以及霍亂弧菌等多種病原菌，變形菌門是土壤中與pH相關性最高的細菌（黃家慶等，2020），而本研究供試土壤呈堿性，添加生物炭對土壤pH沒有顯著影響，故低量生物炭處理對變形菌門相對豐度沒有顯著影響。盧曉蓉等（2019）在研究中指出，在 3%的生物炭添加量下革蘭氏陰性細菌的含量最高，而4%和5%的生物炭添加量下土壤各類磷脂脂肪酸含量呈下降趨勢。這說明生物炭對土壤細菌群落的影響存在閾值，并不存在土壤細菌含量隨生物炭添加量的增加而無限制升高的情況。本研究結果亦表明，高量生物炭較低量生物炭處理，變形菌門降低了5.87%，可能是高量生物炭處理土壤中多環芳烴等有害物質增加的緣故（Spokas et al.，2011；Hale et al.，2012）。與本研究結果不同，殷全玉等（2020）探究連續 4年施用生物炭對褐土土壤細菌多樣性以及群落結構的影響，結果顯示與僅施用30 kg·hm?2的純氮相比，用量15 t·hm?2生物炭處理顯著提高了變形菌門的相對豐度，可能是由于所取土樣在煙草移栽前，避免了根系分泌物的影響。以上研究結果表明，生物炭對細菌群落組成的影響會因試驗年限、取樣部位以及生物炭用量等條件的不同而存在差異。本研究中細菌群落結構與土壤理化性質的冗余分析顯示，生物炭處理對細菌群落結構有一定程度的影響，與細菌群落相關性較大的土壤性質為有機碳和總氮（程揚等，2018；李明等，2015）。土壤中的有機碳為土壤微生物提供了豐富的碳源，同時，氮素是微生物不可缺少的養分元素（施瑤等，2014），由于生物炭的穩定性較高，具有持續增加土壤有機碳的作用，有機碳和總氮的增加，提高了土壤中碳、氮元素的有效性和土壤中相關酶的活性，促進了土壤中微生物的新陳代謝，進而影響細菌的群落結構。

3.2 施用生物炭和炭基肥對大豆根際真菌群落的影響

與對照相比，不同處理均增加了真菌的基因拷貝數（25.0%—86.4%），其中，高量生物炭處理達到了顯著水平（圖1B），說明生物炭添加能提高真菌豐度且增加幅度與施碳量有關。這與Steinbeiss et al.（2009）和Jones et al.（2012）等關于生物炭的添加促進真菌生長的報道一致。Yao et al.（2017b）指出連續3年施用生物炭會促進土壤真菌的生長，尤其是在生物炭量為 8%的高碳量處理下最為顯著，其原因可能是生物炭可以改善土壤的通氣性和保水性，從而為土壤真菌提供更好的生存環境；另外，生物炭的添加可以間接改變土壤pH以及養分含量，進而導致真菌豐度的增加。生物炭可以通過直接或者間接的方式影響土壤真菌群落結構，一方面，大多數真菌在土壤中扮演分解者的角色，與細菌相比，對生物炭中碳利用能力較強（牛亞茹，2016；Lehmann et al.，2011）；生物炭的添加在一定程度上使土壤的物理結構發生了改變，土壤孔隙度增加，養分礦化速度加快，促進了土壤真菌豐度的增加（張又弛等，2015；武玉等，2014）；另一方面，通過改變土壤環境因子，如有機碳、總氮以及速效磷等養分含量，間接促進真菌的生長與繁殖。

土壤真菌群落結構與土壤理化性質的 RDA分析表明，生物炭和炭基肥的添加改變了真菌群落結構，且高量生物炭的施用對真菌群落結構的影響更為顯著；并且有機碳、總氮和速效鉀對真菌群落結構具有顯著影響，這與吳憲等（2020）和季凌飛等（2018）的研究結果相一致。生物炭具有較強的吸附性，能夠吸附土壤中的磷、鉀、鎂等不同存在形態的營養元素，豐富了土壤中有效性營養元素的含量，為真菌提供養分來源（Zhu et al.，2017；吳濤等，2017）；同時，土壤中的碳、氮水平可以調節土壤真菌對其利用能力，增加土壤相關酶的活性，從而影響真菌群落結構（王軼等，2014；Lauber et al.，2008；Liu et al.，2015）。肖禮等（2017）在關于不同種植年限、不同種植類型下真菌群落組成影響因素的研究中發現，子囊菌門的相對豐度主要受總氮、速效鉀的影響，接合菌門受土壤容重的影響較大，有機碳含量主要影響擔子菌門。在本研究中，生物炭施用對真菌門水平上相對豐度沒有顯著影響，而真菌群落的Chao1指數和ACE指數隨著生物炭添加量明顯增加，同時，高量生物炭顯著提高了真菌的均勻度指數（表2）。不同施用量的生物炭對真菌群落多樣性影響不同，主要表現為真菌群落的豐富度和多樣性的變化，其影響程度也與生物炭種類密切相關。這可能與生物炭獨特的結構有關，生物炭具有較強的吸附性和疏松多孔等特點，給真菌提供了一個得天獨厚的避難場所，有利于真菌的生長繁殖和多樣性的增加（Meng et al.，2019；陳義軒等，2019）。

4 結論

生物炭和炭基肥的添加對大豆根際細菌豐度沒有影響，但在一定程度上改變了細菌群落結構，體現在生物炭的添加顯著降低了變形菌門的相對豐度。同時，高量生物炭處理顯著提高了土壤真菌豐度和多樣性指數，并改變了真菌群落結構。生物炭可以通過改善土壤的理化性質間接引起微生物群落結構的改變。