藤梨根化學成分及其體外抗腫瘤轉移活性

甘椿椿，金 湛，魏曉鵬，靳美娜?

（1.衢州職業技術學院，浙江衢州 324000；2.天津醫科大學，天津 300070）

藤梨根為中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch的根，為獼猴桃科獼猴桃屬植物。臨床上以單方或者復方用于胃癌、肝癌、直腸癌等惡性腫瘤以及胃病、肝病、前列腺炎等疾病的治療。已報道的從藤梨根中分離鑒定化學成分超過90 種［1］，主要包括三萜類、黃酮類、蒽醌類、甾體及其苷類、生物堿類、酚酸類、糖類、氨基酸、揮發油、無機金屬元素以及其他類，隨著研究的不斷深入，其化學成分的種類和數量不斷增加?，F代藥理學研究表明，藤梨根中的化學成分具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂、保肝、提高免疫力等藥理活性［2-3］，抗腫瘤作用一直是研究的熱點，目前也取得了一定進展［4］。但是，抗腫瘤轉移作用方面的研究鮮有報道，本研究前期工作基礎表明，藤梨根乙醇提取物能夠明顯抑制乳腺癌MDA-MA-231 細胞的轉移［5］。因此本實驗對藤梨根進行化學成分研究，同時測定單體化合物的抗腫瘤轉移活性，以期豐富藤梨根的藥理活性，開發新的抗腫瘤轉移先導化合物。

1 材料

Bruker AV 500 核磁共振儀（TMS 內標）、Bruker esquire 3000 00142 質譜儀（德國Bruker 公司）；LC-3000 島津半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；YMC-Pack ODS-A SH-343-5 色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）、柱色譜和薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；Toyoperl HW-40C、HW-40F、LH-20 柱填料（日本Tosoh 公司）；CO2細胞培養箱（美國熱電公司）；全自動酶標板分析儀（美國BioTek 儀器有限公司）；AE2000 倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；移液器（德國Eppendorf 公司）；Transwell 小室（美國康寧公司）；所用試劑均為分析純；LY294002（上海碧云天生物技術有限公司）；乳腺癌MDA-MB-231 細胞購自中科院上海細胞庫。

藤梨根藥材于2018 年7 月采自浙江衢州，經衢州瑞草堂醫藥有限公司汪建剛主任中藥師鑒定為正品，標本（B20180720）存放于衢州瑞草堂醫藥有限公司。

2 提取與分離

藤梨根乙醇提取物以及不同極性有機溶劑萃取部位為前期研究工作的基礎［5］。藤梨根乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇溶解，用300 g 硅藻土拌樣，經硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（95 ∶5～70 ∶30）梯度洗脫得8 個組分（Fr.1～8），Fr.2 經Sephadex HW-40 凝膠柱二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫分離純化，重結晶（甲醇）后得化合物1（312.0 mg）。Fr.3 經硅膠柱石油醚-乙酸乙酯（5 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫得Fr3.1～3.4，Fr3.2 經凝膠滲透色譜二氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫得化合物2（6.1 mg）；Fr3.3 經半制備HPLC 甲醇-水（85 ∶15）洗脫得化合物3（10.5 mg）、8（21.1 mg）。Fr.4 經Sephadex HW-40 凝膠柱二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫分為3 段Fr.4.1～4.3，Fr.4.1 經反復制備型HPLC（95% 甲醇）分離，重結晶（甲醇）得化合物4（17.0 mg）、5（15.7 mg）、6（18.7 mg）。Fr.5 經硅膠柱層析氯仿-甲醇（50 ∶1～5 ∶1）梯度洗脫得Fr5.1～5.5，Fr5.2 經凝膠滲透色譜二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫得化合物7（7.6 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：414.3，分子式C29H50O，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。3 種溶劑展開體系分別為石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、二氯甲烷-甲醇與對照品Rf 值相同。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：0.69（3H，s，H-18），0.79～0.87（9H，m，H-26，27，29），0.93（3H，d，J ＝6.4 Hz H-21），1.02（3H，s，H-19），2.20～3.29（2H，m，H-4），3.49（1H，brs，H-3），5.35（1H，s，H-6）。以上數據與文獻［6］基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物2：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：454.3，分子式C30H46O3，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.88（3H，s，H-25），0.92（3H，d，J ＝6.2 Hz，H-30），1.00（3H，d，J ＝6.1 Hz，H-29），1.08，1.10，1.12，1.13（each 3H，s，H-26，H-24，H-23，H-27），2.21（1H，d，J ＝11.3 Hz，H-18），5.31（1H，brs，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：39.0（C-1），19.9（C-2），217.7（C-3），39.4（C-4），55.6（C-5），19.6（C-6），33.7（C-7），40.6（C-8），48.8（C-9），37.1（C-10），23.8（C-11），125.9（C-12），138.5（C-13），42.7（C-14），26.9（C-15），24.5（C-16），48.4（C-17），52.9（C-18），39.7（C-19），39.8（C-20），31.0（C-21），37.1（C-22），28.4（C-23），21.8（C-24），15.6（C-25），15.9（C-26），23.8（C-27），184.1（C-28），17.3（C-29），21.6（C-30）。以上數據與文獻［7］基本一致，故鑒定為3-氧代-12-烯-28-烏蘇酸。

化合物3：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：456.3，分子式C30H48O3，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。多種溶劑展開體系與對照品Rf 值相同。1HNMR（500 MHz，CDCl3） δ：0.70（3H，s，H-24），0.75（3H，s，H-25），0.80（3H，d，J ＝6.3 Hz，H-29），0.88，0.93，1.03，1.20，（each 3H，s，H-30，23，26，27），2.12（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-18），3.16（1H，dd，J ＝11.3，4.7 Hz，H-3），5.20（1H，t，J ＝11.1 Hz，H-12）。以上數據與文獻［8］基本一致，故鑒定為烏蘇酸。

化合物4：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：488.3，分子式C30H48O5，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.92（3H，s，H-30），0.95（3H，s，H-29），1.01（3H，s，H-25），1.05（3H，s，H-27），1.17（3H，s，H-26），1.70（3H，s，H-23），3.83（1H，d，J ＝10.9 Hz，H-24），4.12（1H，d，J ＝10.7 Hz，H-3），4.45（1H，d，J ＝10.9 Hz H-24′），4.60（1H，brs，H-2），5.45（1H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：43.0（C-1），66.1（C-2），74.0（C-3），44.0（C-4），49.3（C-5），19.0（C-6），33.8（C-7），40.3（C-8），48.0（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.5（C-12），138.9（C-13），42.7（C-14），28.8（C-15），25.1（C-16），48.2（C-17），53.5（C-18），39.5（C-19），39.5（C-20），31.2（C-21），37.5（C-22），23.9（C-23），65.5（C-24），17.0（C-25），17.2（C-26），23.9（C-27），180.5（C-28），17.5（C-29），21.4（C-30）。以上數據與文獻［9］基本一致，故鑒定為2α，3α，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物5：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：488.3，分子式C30H48O5，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.88（3H，d，J ＝6.4 Hz，H-30），0.93（3H，s，J ＝6.3，H-29），0.85，0.97，1.03，1.10（each 3H，s），1.05（3H，d，J ＝11.1 Hz，），2.60（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-18），3.74，3.89（each 1H，d，J ＝10.9 Hz，H-23），4.11（1H，d，J ＝10.7 Hz H-3），4.25（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-2），5.45（1H，s，H-12）；13CNMR（125 MHz，C5D5N） δ：42.9（C-1），66.3（C-2），79.0（C-3），50.3（C-4），43.5（C-5），18.5（C-6），33.3（C-7），42.0（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.3（C-12），139.5（C-13），42.7（C-14），28.8（C-15），25.0（C-16），48.1（C-17），53.5（C-18），39.3（C-19），39.4（C-20），31.1（C-21），37.5（C-22），71.3（C-23），17.0（C-24），17.3（C-25），17.5（C-26），24.0（C-27），180.0（C-28），17.9（C-29），21.2（C-30）。以上數據與文獻［10］基本一致，故鑒定為2α，3α，23-三羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物6：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：472.3，分子式C30H48O4，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.97（3H，d，J ＝6.4 Hz，H-30），0.98（3H，d，J ＝4.8 Hz，H-29），0.96，1.03，1.05，1.20，1.27（each 3H，s，-CH3），2.61（1H，d，J ＝11.3 Hz，H-18），3.41（1H，d，J ＝9.2 Hz，H-3），4.10（1H，t，J ＝7.8，H-2），5.47（1H，brs，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：48.1（C-1），68.7（C-2），83.9（C-3），39.5（C-4），56.0（C-5），19.0（C-6），33.6（C-7），40.3（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.5（C-12），139.5（C-13），42.8（C-14），28.8（C-15），25.0（C-16），48.3（C-17），53.4（C-18），40.0（C-19），39.5（C-20），31.2（C-21），37.6（C-22），29.5（C-23），17.9（C-24），17.7（C-25），17.5（C-26），24.0（C-27），181.0（C-28），17.1（C-29），21.6（C-30）。以上數據與文獻［11］基本一致，故鑒定為2α，3β-二羥基齊墩果烷-12-烯-28 酸。

化合物7：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：504.3，分子式C30H48O6，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.92（3H，d，J ＝6.5 Hz，H-30），0.96（3H，d，J ＝6.3 Hz，H-29），1.05，1.10，1.13，（each 3H，s，-CH3），2.59（1H，d，J ＝11.1 Hz，H-18），3.99（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-24′），4.28（1H，d，J ＝10.8 Hz，H-23′），4.33（1H，d，J ＝9.6 Hz，H-3），4.43（1H，m，H-2），4.56（1H，d，J ＝11.1 Hz，H-24），4.85（1H，d，J ＝10.9 Hz，H-23），5.46（1H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：48.1（C-1），69.1（C-2），79.9（C-3），47.4（C-4），44.8（C-5），19.1（C-6），33.7（C-7），40.5（C-8），47.9（C-9），38.1（C-10），24.3（C-11），127.9（C-12），139.9（C-13），42.1（C-14），29.0（C-15），26.5（C-16），48.3（C-17），54.7（C-18），72.7（C-19），42.2（C-20），26.9（C-21），38.5（C-22），69.0（C-23），64.1（C-24），16.9（C-25），16.8（C-26），24.5（C-27），180.5（C-28），27.1（C-29），17.0（C-30）。以上數據與文獻［10］基本一致，故鑒定為2α，3β，23，24-四羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物8：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：576.4，分子式C35H60O6。多種溶劑展開體系與對照品Rf 值相同。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.68（3H，s，H-18），0.86～0.89（6H，m，H-26，27），0.92（3H，s，H-29），0.96（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J ＝6.4 Hz，CH3），2.49～2.81（1H，m，H-4），5.35（1H，d，J ＝4.5 Hz，H-6），5.01（1H，d，J ＝7.7 Hz，Glc H-1），3.75～3.92（7H，m，H-3，葡糖糖上6 個H）。以上數據與文獻［6］基本一致，故鑒定為胡蘿卜苷。

4 活性篩選

實驗結果用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，數據均以（）表示，采用兩獨立樣本t 檢驗統計學方法，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

4.1 MTT 實驗 參考文獻［5］，采用MTT 實驗檢測化合物在不同濃度下對乳腺癌細胞MDA-MB-231 的細胞毒性，結果顯示，化合物3～6 在10、50 μmol／L 濃度作用下均能明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖，顯示出較強的細胞毒性，而化合物2、7 在10 μmol／L 濃度作用下沒有細胞毒作用，對MDA-MB-231 細胞的增殖沒有影響?；衔?、8 在10、50 μmol／L 濃度作用下均沒有細胞毒作用，見表1。

表1 各化合物對MDA-MB-231 細胞的生長抑制率（）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on MDA-MB-231 cells（）

表1 各化合物對MDA-MB-231 細胞的生長抑制率（）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on MDA-MB-231 cells（）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4.2 劃痕實驗 參考文獻［5］，劃痕實驗結果顯示化合物7 能夠劑量依賴性地抑制MDA-MB-231 細胞的遷移，其IC50值為1.161 μmol／L。LY294002是磷脂酰肌醇3-激酶的特異性抑制劑，能夠明顯抑制腫瘤細胞轉移。在10 μmol／L 濃度下，化合物7 對MDA-MB-231 細胞遷移抑制的效果明顯強于陽性對照藥LY294002（10 μmol／L），見圖1。

4.3 Transwell 實驗 參考文獻［5］，進一步采用Transwell 實驗測定化合物7 在非細胞毒劑量下對乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲的影響，見圖2，化合物7 能夠明顯抑制MDA-MB-231 細胞的侵襲，并呈一定劑量依賴性，IC50值為1.091 μmol／L。在10 μmol／L 濃度下，化合物7 對MDA-MB-231 細胞侵襲抑制的效果明顯強于陽性對照藥LY294002（10 μmol／L）。

圖2 化合物7 對MDA-MB-231 細胞侵襲的影響Fig.2 Effect of compound 7 on invasion of MDA-MB-231 cells

5 討論

在眾多有關藤梨根藥理活性的研究報道中，關于抗腫瘤轉移作用方面的研究鮮有報道。郭清戈、郭勇等［12-13］發現復方藤梨根制劑能夠有效抑制小鼠結腸癌人工肺轉移。徐玲等［14］發現復方藤梨根制劑能夠有效抑制胃癌轉移，其機制可能與下調HPA、 MMP-9 基因的表達有關。張廣順等［15］發現藤梨根總三萜化合物能夠明顯抑制胃癌細胞的侵襲。以上研究僅限于藤梨根復方制劑和總三萜化合物，而關于藤梨根單體化合物的抗腫瘤轉移活性研究尚未見報道。

本實驗從藤梨根中共分離得到8 個化合物，其中化合物2、7 從該植物中首次分離得到。本研究前期通過MTT 實驗確定了化合物的非細胞毒劑量，繼而采用劃痕和Transwell 實驗，評價化合物7 對體外乳腺癌細胞轉移的影響。結果顯示化合物7 具有明顯的體外抗腫瘤轉移活性，其作用機制可能與抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲相關。研究首次確定了藤梨根中單體化合物具有明顯的體外抗腫瘤轉移活性，以期為中藥藤梨根的現代應用提供實驗依據，為抗腫瘤轉移藥物的開發奠定基礎。