豬圓環病毒2 型熒光定量PCR 檢測試劑盒原材料研究

張曉霞,張 琪,張皖靜,趙悅琪,吳文靜,楊 丹,許 燕,趙 凱3

(1 上海師范大學生命科學學院,上海200234;2 上海博滿生物科技有限公司,上海201106;3上海市農業科學院生物技術研究所,上海201106)

豬圓環病毒(Porcine circovirus type,PCV)為圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus genus)的成員[1-2]。該病毒有兩個血清型,即豬圓環病毒1 型(PCV1)和豬圓環病毒2 型(PCV2)[3]。通常認為,PCV1 不具致病性,但PCV2 具有致病性,是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原[4]。PCV2 主要破壞豬的免疫系統,造成機體免疫抑制,抵抗力降低,產生其他病原微生物的繼發感染[5-6]。PCV2 也與豬的其他多種臨床疾病密切相關[7-8]。自1997年在加拿大首次報道PMWS 以來,PCV2 流行范圍不斷擴大,給養豬業造成了巨大的經濟損失[9-11]。PCV2 感染豬的初期診斷與病豬的淘汰是PMWS 防治的關鍵,開發豬的PCV2 的定性、定量快速檢測方法很有必要。

目前,PCV2 的檢測技術主要有免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術。免疫學檢測技術有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、單層過氧化物酶試驗(IPMA)等。其中,ELISA、IFA 和IPMA 主要用于PCV2 血清的檢測[12-13]。PCV2 的分子生物學檢測技術中最常見的是PCR 技術,但常規PCR 一般只能定性,不能定量。基因芯片通過熒光染料信號強度來推算每個探針對應的樣品量,但是定量效果不好[14]。實時熒光定量PCR 技術(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)是以定性PCR 技術為基礎發展起來的,是目前敏感性最高的核酸檢測和定量技術。FQ-PCR 技術是根據熒光共振能量轉移原理,在PCR 反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR 進程,最后通過Ct 值(Cycle threshod,循環閾值)和標準曲線對未知模板的起始濃度進行定量[15-16]。Ct 值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。每個模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,且起始拷貝數越多,Ct 值越小[17-19]。熒光定量PCR 靈敏度高、特異性強、無污染、快速、準確,在臨床檢驗及生命科學研究方面具有重要的意義[20-22]。本實驗室已建立了PCV2 實時熒光定量PCR 檢測方法,該方法已被美國佐治亞疾控中心所采用,且已經研制出PCV2 熒光定量PCR 檢測試劑盒。本研究通過熒光定量PCR 技術對試劑盒主要原材料進行優化,以期為后續藥證申報奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

PCV2 毒株,由本實驗室保存。陽性參考品:PCV2 病毒培養液;陰性參考品:豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(SFV),均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所惠贈。

1.2 主要試劑

熒光定量PCR 試劑盒原材料用的Taq 酶和PCR 反應緩沖液兩者為配套試劑,共購置3 套,Group 1:Taq DNA Polymerase(with PCR Reaction Buffer)(上海博彩生物科技有限公司);Group 2:Ex Taq?HotStar version(with PCR Reaction Buffer)[Takara 寶生物工程(上海)有限公司];Group 3:Ex Taq?(with PCR Reaction Buffer)[Takara 寶生物工程(上海)有限公司]。Uracil-DNA-Glycosylase(UDG)酶購置于3 家公司,Group 1:上海博彩生物科技有限公司;Group 2:南京諾唯贊生物科技有限公司;Group 3:北京康為世紀生物科技有限公司。熒光定量PCR 引物和TaqMan 探針由上海生工生物技術有限公司合成;病毒基因組DNA∕RNA 提取試劑盒和質粒提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物和探針設計

以PCV2(BJ0804 株)ORF2 基因(GenBank 登錄號為EU921257.1)序列作為靶序列(全長149 bp),使用Primer Premier 5.0 軟件設計引物和探針,使用Oligo DNAMAN 4.0 和Primer Analysis 進行序列比對分析。引物與探針信息見表1。

表1 PCV2 引物和探針序列Table 1 Sequence of primers and probe of PCV2

1.4 PCV2 熒光定量PCR 檢測試劑盒使用方法

體系配置間:在此房間完成熒光定量PCR 總體系的配置。具體如下:于1.5 mL 離心管中加入Premix(內含10 ×Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq 酶、UDG 酶和Rox 矯正染料)11.9 μL,Primer1 和Primer2 各0.9 μL,Probe 0.4 μL,用滅菌雙蒸水補至20 μL。渦旋混勻,瞬時離心,然后將配置好的總體系分裝到8 連PCR 排管中。所有的熒光定量PCR 反應均平行重復3 次。此房間不能放置陽性模板或PCR 反應產物。

模板間:將配好的PCR 體系在模板間加入模板DNA∕參考品∕對照品∕待檢樣品5 μL,立即蓋嚴管蓋,瞬離,避免產生氣泡。模板要按照拷貝數從低到高的順序依次加入且此房間不能放置PCR 體系配制的原料。

擴增間:熒光定量PCR 反應的擴增程序為37 ℃5 min;94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸31 s(此階段收集熒光信號),45個循環。反應結束后進行熒光定量PCR 擴增結果分析。

1.5 試劑盒標準陽性對照的制備

陽性對照是含有PCV2 靶基因片段的質粒,用分光光度計測定其含量,并根據病毒學方法計算出質粒濃度對應的拷貝數。質粒做10 倍梯度稀釋后作為模板進行熒光定量PCR 擴增。

1.6 空白對照的制備

空白對照為無RNA 酶的無菌水。用移液器量取1 mL 的DEPC,補純化水至1000 mL,混勻,121 ℃、20 min 滅菌,室溫保存。

1.7 陽性參考品、最低檢測限參考品和精密性參考品的制備

分取200 μL 已滅活的PCV2 病毒培養液的母液,按照病毒基因組DNA∕RNA 提取試劑盒說明書進行核酸提取。按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進行熒光定量PCR 檢測。

1.8 Taq 酶和熒光定量PCR 反應緩沖液的優選試驗

將3 家公司生產的Taq 酶和熒光定量PCR 反應緩沖液,與UDG 酶按照供應商說明書進行配制,分別加入濃度為1 ×107拷貝∕mL 和1 ×104拷貝∕mL PCV2 病毒DNA,按照設定程序進行熒光定量PCR 檢測,重復3 次。評價3 家公司的Taq 酶和PCR 反應緩沖液對PCR 反應的影響。

1.9 UDG 酶的優選試驗

將3 家公司生產的UDG 酶與Taq 酶和PCR 反應緩沖液按照供應商說明書進行配制,分別加入含dUTP的PCV2 DNA 擴增產物(濃度分別為1 ×107拷貝∕mL、1 ×106拷貝∕mL、1 ×105拷貝∕mL、1 ×104拷貝∕mL和1×103拷貝∕mL)或陽性對照,按照說明書設定程序進行熒光PCR 檢測,重復3 次。

1.10 陽性對照

將PCV2 的質粒按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進行熒光定量PCR 檢測。檢測結果中Ct 值范圍為25—30 對應的濃度梯度的PCV2 病毒質粒等體積混合后為陽性對照。置于-20 ℃條件下保存,長期保存則置于-70 ℃條件下。

1.11 陽性參考品、最低檢測限參考品和精密性參考品試驗

將PCV2 的核酸DNA 按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進行熒光定量PCR 擴增檢測,重復3 次。

2 結果與分析

2.1 Taq 酶和熒光定量PCR 反應緩沖液的優選試驗

如表2 所示,當樣本濃度為106拷貝∕μL 時,Group 1、Group 2 和Group 3 的Ct 值沒有顯著性差異,Group 2 的熒光增長值高于Group 1 和Group 3;樣本濃度為102拷貝∕μL 時,Group 1、Group 2 的Ct 值沒有顯著性差異,Group 2 的熒光增長值高于Group 1,Group 3 未獲得Ct 值且無熒光增長值。綜上,Group 2 的產品試劑效果最佳。

表2 3 家公司Taq 酶和PCR 反應緩沖液的優選Table 2 Optimization of Taq enzyme and PCR reaction buffer from three companies

2.2 UDG 酶的優選試驗

PCR 產物受污染會造成假陽性。如表3 所示,根據熒光定量PCR 擴增結果的Ct 值判斷,無論是含有dUTP 的高濃度PCR 產物還是低濃度PCR 產物,Group 1、Group 2 和Group 3 均能有效消除污染,之間沒有顯著性變化,綜合考慮質量和價格因素,選擇Group 1。

表3 3 家公司UDG 酶的比對優選Table 3 Comparison and optimization of UDG enzymes from three companies

2.3 陽性參考品、最低檢測限參考品和精密性參考品試驗

如圖1A 所示,檢測結果中Ct 值范圍為20—25 對應的濃度梯度的PCV2 病毒核酸提取液等體積混合后作為陽性參考品。檢測結果中Ct 值范圍為30—35 對應的濃度梯度的PCV2 病毒核酸提取液等體積混合后作為最低檢測限參考品。檢測結果中Ct 值范圍為20—25 對應的濃度梯度的PCV2 的病毒培養液(工作液)等體積混合后作為精密性參考品。以上參考品置于-20 ℃保存,長期保存置于-70 ℃。

2.4 陰性參考品試驗

對陰性參考品、陽性對照和陰性對照進行熒光定量PCR 檢測,結果如圖1B 所示,陽性對照有典型的S 型擴增曲線、陰性參考品和陰性對照均無擴增,說明PRV、PRRSV、SFV 病毒與PCV2 病毒均無交叉反應。

圖1 陽性參考品、最低檢測限參考品、精密性參考品和陰性參考品的熒光定量PCR 擴增Fig.1 Fluorescent quantitation PCR amplification of positive reference,the lowest detection limit reference,precision reference and negative reference

3 結論與討論

本試驗選擇不同的靶序列并設計了不同的引物和探針來檢測PCV2,發現已建立的熒光定量PCR 檢測方法PCV2 的檢測率比普通PCR 高18%。這不僅提供了一種快速定量檢測PCV2 的方法,也可應用于評價PCV2 疫苗。

本研究對比了3 家公司生產的Taq 酶、PCR 反應緩沖液試劑,結果表明Takara 寶生物工程(上海)有限公司生產的Taq 酶、PCR 反應緩沖液的試劑擴增效果最佳;在3 家公司生產的UDG 酶試劑的比對研究中,上海博彩生物科技有限公司所生產的UDG 酶的質量和價格最優,能夠有效消除污染;在試劑盒參考品研究中,對陽性參考品、最低檢測限參考品、精密性參考品進行制備和定值,保證試劑盒在檢測應用中的參照標準和靈敏度,使這種檢測方法更加標準和規范化;在試劑盒陰性參考品研究中,設置了PRV、PRRSV、SFV 3個病毒和陽性對照進行熒光定量PCR 試驗,結果顯示陰性參考品無交叉反應,說明陰性參考品具有優良的特異性;在試劑盒的質控品研究中設置了陽性對照和空白對照,保證試劑盒的質量控制。下一步將會繼續進行該試劑盒穩定性、生產工藝及反應體系、參考值、分析性能評估、臨床考核等等方面的研究。該研究可為業內同行藥證申報提供參考。