響應面法優化羅氏沼蝦復合保鮮工藝的研究

楊 豐,沈思遠,黃海源,陳露珠,施文正,2,汪之和,2,3

(1 上海海洋大學食品學院;2 國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海);3上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海201306)

羅氏沼蝦(Macrobyachium rosenberqii)又稱馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦,廣泛分布于印度洋、太平洋區域之熱帶和亞熱帶地區。近年來,隨著水產養殖技術的不斷提高,我國羅氏沼蝦養殖總產量快速上升[1],2017年中國羅氏沼蝦養殖產量為1.374 ×105t,比2016年增長8.51%[2]。羅氏沼蝦殼薄體肥、肉質鮮嫩、味道鮮美、營養豐富,因此備受廣大消費者青睞。但是由于羅氏沼蝦季節性較強且產量大,需要在集中收獲期對其進行保鮮,延長貨架期,滿足各地消費者的需求。

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種天然生物抑菌劑,具有安全性高、熱穩定性強以及抑菌譜廣等優點[3],在水產品保鮮中廣泛運用。侯偉峰等[4]在3—5 ℃條件下用0.1%ε-PL 處理南美白對蝦可以延長2—3 d 的貨架期。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是一種天然抗氧化劑,主要表現在螯合金屬離子、清除活性氧自由基、抑制氧化酶以及促進抗氧化酶活性等方面[5]。熊青等[6]研究表明,茶多酚及其復配生物保鮮劑能有效提高南美白對蝦品質。殼聚糖(Chitosan,CS)是由自然界普遍分布的幾丁質脫乙酰化處理后制得的天然高分子聚合物,具有良好成膜性,可阻隔細胞內外物質傳遞[7]。Soyoung 等[8]將2%殼聚糖與聚賴氨酸涂膜用于太平洋白蝦,可有效延長保質期至12 d。

目前,對于羅氏沼蝦保鮮技術的報道主要是采用凍藏保鮮和氣調保鮮等,而保鮮劑的開發應用鮮有報道。本研究考察不同保鮮功能的復合保鮮劑對羅氏沼蝦在冷藏(4 ±1)℃的保鮮效果,以期揭示該復合保鮮劑對水產品品質的影響,并通過響應面法優化出高效、低成本、安全的復合保鮮劑配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗時間為2019年6—8月份。鮮活羅氏沼蝦:購于上海市浦東新區果園鎮農貿市場,平均體質量(25.00 ±5.00)g,體長(10.00 ±2.00)cm,充氧活運至實驗室。三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氯化鈉、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、輕質氧化鎂、氫氧化鈉、高氯酸、氫氧化鉀、冰醋酸:分析純,國藥集團化學試劑有限公司。平板計數瓊脂:生化試劑,國藥集團化學試劑有限公司。溶菌酶、茶多酚、植酸、殼聚糖、海藻酸鈉、普魯蘭多糖:食品級,浙江一諾生物科技有限公司。乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸:食品級,浙江新銀象生物工程有限公司。4-己基間苯二酚:食品級,上海瑞祥生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

艾美特SZ3002 真空保鮮機:深圳艾美特科技股份有限公司。SHP-2500 型低溫生化培養箱:上海精宏實驗設備有限公司。FOSS Kjeltec 8400 型全自動凱氏定氮儀:丹麥FOSS 公司。H2050R 型高速冷凍離心機:長沙湘儀有限公司。UV-1800PC 型紫外-可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司。FE20 型pH計:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。DSX-280KB24 型手提式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫療器械廠。BCM 型垂直雙人標準凈化工作臺:蘇凈集團安泰公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將鮮活羅氏沼蝦浸沒在冰水中致其昏死,挑選個體大小一致,蝦體完整的羅氏沼蝦分別浸漬在保鮮劑溶液中10 min,取出瀝干后快速分裝聚乙烯保鮮袋,并用封口機封口,放置在(4 ±1)℃生化培養箱中進行保鮮試驗,每2 d 取樣測定總揮發性鹽基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)值、菌落總數以及感官評定等指標。

1.3.2 單一保鮮劑的篩選

分別選取抑菌型保鮮劑(乳酸鏈球菌素、溶菌酶、ε-聚賴氨酸),抗氧化型保鮮劑(茶多酚、4-己基間苯二酚、植酸),涂膜型保鮮劑(殼聚糖、海藻酸鈉、普魯蘭多糖)等9 種不同保鮮劑,分別設置抑菌型保鮮劑濃度為0.1%,抗氧化型保鮮劑濃度為0.1%,涂膜型保鮮劑為1%,除殼聚糖用含1%冰醋酸,其余為無菌蒸餾水配制,對照組(為無菌蒸餾水)。通過TVB-N、TBA 值、菌落總數以及感官評定等指標分別篩選出相對較好的抑菌型、抗氧化型、涂膜型保鮮劑各一種。

1.3.3 單一保鮮劑濃度的篩選

分別設置抑菌型保鮮劑(ε-聚賴氨酸)、抗氧化型保鮮劑(茶多酚)的濃度為0.1%、0.3%、0.5%;涂膜型保鮮劑(殼聚糖)的濃度為1%、2%、3%,其中設置對照組(以無菌蒸餾水處理)。通過TVB-N、TBA 值、菌落總數以及感官評定等指標分別篩選出相對較好的3 種保鮮劑濃度范圍。

1.3.4 復合保鮮劑濃度的響應面優化

根據單因素試驗的結果,分別選擇ε-聚賴氨酸、茶多酚、殼聚糖不同的質量分數濃度,采用三因素三水平的響應面分析法(表1)。以TVB-N 作為響應值,篩選出最佳配比的復合保鮮劑并進行驗證試驗。

表1 響應面試驗因素水平編碼Table 1 Factors and levels in response surface experiment

1.3.5 響應面優化復合保鮮劑驗證試驗

將預處理后的羅氏沼蝦經過不同處理后隨機分為5 組進行分裝:1)試驗組:響應面試驗的復合保鮮劑組合;2)0.3% ε-聚賴氨酸保鮮對照組;3)0.3%茶多酚保鮮對照組;4)2.3%殼聚糖保鮮對照組;5)對照組:未經任何處理的樣品。分別置于(4 ±1)℃生化培養箱中貯藏,貨架期內測定其TVB-N、TBA、菌落總數、肌肉pH 并進行感官評定,從而研究復合保鮮劑對羅氏沼蝦的保鮮效果。

1.3.6 保鮮指標的測定

1.3.6.1 揮發性鹽基氮(TVB-N)

根據標準GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[9]。

1.3.6.2 硫代巴比妥酸(TBA)值

參考楊陽[10]和馬海建等[11]的方法,準確稱取蝦肉樣品5.00 g,加入25 mL 的20%三氯乙酸溶液和20 mL蒸餾水,勻漿并靜置1 h 后冷凍離心10 min(4 ℃,8000 r∕min),取上清液過濾后定容至50 mL,取5 mL的濾液加入0.02 mol∕L 硫代巴比妥酸溶液5 mL,沸水浴中反應20 min,取出后流水冷卻5 min,于532 nm 處測吸光度A。以蒸餾水為空白樣,平行測定3 次,取平均值。TBA 值=A×7.8 mg∕(100 g)。

1.3.6.3 菌落總數

根據標準GB 4789.2—2016《食品衛生微生物檢驗 菌落總數測定》[12]。

1.3.6.4 肌肉pH

取蝦肉2 g,加入18 mL 蒸餾水,勻漿2 min,靜置30 min 后取上清液,采用pH 計測定。

1.3.6.5 感官評價

感官評定由10 名有感官評定經驗的人員組成,總分6 分以下表示蝦已不可食用。羅氏沼蝦感官評分標準見表2。

表2 羅氏沼蝦綜合感官評分Table 2 Sensory evaluation of Macrobrachium rosenbergii

1.4 數據處理

使用SPSS 24.0 軟件對試驗結果進行分析,在單因素方差分析(ANOVA)的基礎上采用最小極差法(LSD)進行組間比較,取P＜0.05 為差異顯著,利用Origin 9.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單一保鮮劑篩選

2.1.1 3 種抑菌型保鮮劑篩選

如圖1 所示,TVB-N、菌落總數隨貯藏時間的延長總體上升,感官評分逐漸下降,抑菌組明顯好于對照組。在保鮮第4 天時,對照組的TVB-N 值已超過20 mg∕(100 g),0.1%乳酸鏈球菌素和0.1%溶菌酶組在保鮮第6 天時已腐敗,而0.1%ε-聚賴氨酸組在第8 天的TVB-N 值為19.83 mg∕(100 g);0.1%乳酸鏈球菌素和0.1%溶菌酶組的菌落總數在貯藏8 d 內均高于0.1%ε-聚賴氨酸組,三種保鮮劑的菌落總數均呈先下降后上升趨勢,可能是蝦體本身所攜帶的細菌受低溫和抑菌保鮮劑雙重抑制,生長出現延滯期,而后隨著貯藏時間延長,細菌逐漸適應了環境,蝦體表面的保鮮劑逐漸滲透細胞內,導致蝦體表剩余保鮮劑的量越來越少,使耐冷微生物不斷繁殖,以致菌落總數逐漸上升[13-14];當感官評分低于6 分時表示消費者已無法接受,在保鮮6 d 時,只有0.1%ε-聚賴氨酸組依然高于6 分。通過TVB-N、菌落總數、感官評價綜合表明抑菌型保鮮劑中的ε-聚賴氨酸處理羅氏沼蝦的保鮮效果較好。

圖1 不同抑菌型保鮮劑對羅氏沼蝦菌落總數、TVB-N 和感官評分的變化Fig.1 Changes of total bacteria counts,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different bacteriostatic preservative

2.1.2 3 種抗氧化型保鮮劑篩選

如圖2 所示,三種抗氧化型保鮮劑的TBA 值均明顯低于對照組,說明它們均能有效抑制蝦肉的脂肪氧化,其中茶多酚組抗氧化效果相對較好,且其第6 天時的TVB-N 值仍然低于20 mg∕(100 g);根據感官評分顯示茶多酚組對于消費者的可接受程度更高。因此選擇茶多酚進行后續試驗。

圖2 不同抗氧化型保鮮劑對羅氏沼蝦TBA、TVB-N 和感官評分的變化Fig.2 Changes of TBA,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different antioxidant preservative

2.1.3 3種涂膜型保鮮劑的篩選

圖3 不同涂膜型保鮮劑對羅氏沼蝦TVB-N、菌落總數和感官評分的變化Fig.3 Changes of TVB-N,total bacteria counts and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different coating preservative

如圖3 顯示,殼聚糖組的TVB-N 值和菌落總數均低于其他兩種涂膜型保鮮劑組,但是在保鮮初期(0—4 d),殼聚糖組的感官評分低于其他兩組,主要原因是配制殼聚糖保鮮劑時加入了1%冰醋酸,在保鮮中后期,殼聚糖組較優。

2.2 單一保鮮劑濃度的篩選

2.2.1 ε-聚賴氨酸濃度的篩選

圖4 分別顯示不同濃度的ε-聚賴氨酸的保鮮效果,0.3%ε-聚賴氨酸的TVB-N 值最優;當質量濃度達到0.5%時新鮮度下降及菌落總數上升,可能是由于ε-PL 分解產生的L-賴氨酸為細菌的生長提供了營養物質,促進了細菌的生長,所以細菌總數反而有所增加[15];0.1%ε-聚賴氨酸因為濃度較低,感官評分在保鮮2—4 d 時相比0.5%ε-聚賴氨酸明顯下降,而后兩個濃度之間差異不大,0.3%ε-聚賴氨酸的感官評分在貯藏8 d 內均最高。因此選擇0.2%—0.4%作為ε-聚賴氨酸的適宜保鮮濃度范圍。

圖4 不同濃度的ε-聚賴氨酸對羅氏沼蝦菌落總數、TVB-N 和感官評分的變化Fig.4 Changes of total bacteria counts,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of ε-PL

2.2.2 茶多酚濃度的篩選

由圖5 可知,0.3%質量濃度的茶多酚處理羅氏沼蝦的抗氧化性和保鮮效果最優,TBA 值隨著保鮮時間總體呈上升趨勢,并且均顯著低于其他濃度組;TVB-N 值表明0.3%茶多酚組的貨架期可達8 d;另外高濃度的茶多酚會使蝦體的表面色澤變黃,影響消費者的可接受程度。因此選擇0.2%—0.4%作為茶多酚的適宜保鮮濃度范圍。

圖5 不同濃度的茶多酚對羅氏沼蝦TBA、TVB-N 和感官評分的變化Fig.5 Changes of TBA,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of TP

2.2.3 殼聚糖濃度的篩選

如圖6 所示,隨著殼聚糖質量濃度的增加,保鮮和抑菌效果越好,而感官評分中3%殼聚糖保鮮組低于2%殼聚糖保鮮組,可能是高濃度的殼聚糖不易溶解,并且非常黏稠,不易形成干燥的薄膜,且因加入了冰醋酸,有較強的酸味,因此選擇1.5%—2.5%作為殼聚糖的適宜保鮮濃度。

2.3 響應面優化試驗結果

利用Design-Expert 10.0 軟件對表3 的數據進行回歸擬合,得到TVB-N 值對ε-聚賴氨酸濃度、茶多酚濃度、殼聚糖濃度三個因素的二次多項回歸方程模型為:

式中:Y為TVB-N值;A為ε-聚賴氨酸濃度;B為茶多酚濃度;C為殼聚糖濃度。

圖6 不同濃度的殼聚糖對羅氏沼蝦TVB-N、菌落總數和感官評分的變化Fig.6 Changes of TVB-N,total bacteria counts and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of CS

表3 響應面試驗方案及結果Table 3 Program and test result of response surface experiment

表4 回歸模型的方差分析Table 4 The variance analysis of regression model

回歸模型的方差分析見表4。表4 顯示該模型的F值為357.52,P＜0.0001,說明該模型是極顯著的;失擬項的P值為0.5224(P＞0.05),表示不顯著,R2=0.9978,說明該模型是可靠的,擬合程度較好;另外一次項A、B、C 的回歸系數均極顯著,說明ε-聚賴氨酸濃度、茶多酚濃度、殼聚糖濃度三個因素對羅氏沼蝦TVB-N 值有很強的影響作用;交互項中AB、AC、BC 達到極顯著水平(P＜0.01);根據一次項的F值,可知各試驗因素對響應值TVB-N 值的影響強弱順序為:ε-聚賴氨酸濃度＞殼聚糖濃度＞茶多酚濃度。綜上說明,該試驗設計是可靠的并且可以用來預測各種因素對TVB-N 的影響。

圖7 是各因素交互作用對TVB-N 值的影響的響應面3D 圖,響應面圖的等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示不顯著[16-17]。響應面圖的等高線均為橢圓形,各因素相互作用顯著。

圖7 ε-聚賴氨酸、茶多酚和殼聚糖濃度的交互作用影響TVB-N 的響應面3D 示意Fig.7 Interaction of ε-PL,TP and CS concentrations effect TVB-N of response surface 3D diagram

2.4 最優工藝參數及驗證試驗

根據Design-Expert 10.0 軟件分析和數據優化,得到最優工藝條件:ε-聚賴氨酸濃度為0.32%、茶多酚濃度為0.33%、殼聚糖濃度為2.26%;根據實際可操作性,將其修正為:ε-聚賴氨酸濃度為0.3%、茶多酚濃度為0.3%、殼聚糖濃度為2.3%;通過3 次驗證試驗,保鮮第8 天的TVB-N 值達到18.06 mg∕(100 g),接近預測值,表明響應面法優化羅氏沼蝦復合保鮮工藝是穩定可行的。

2.5 復合保鮮劑對羅氏沼蝦保鮮效果的影響

圖8 不同保鮮處理對羅氏沼蝦pH、TVB-N、菌落總數、TBA 和感官評分變化Fig.8 Changes of pH,TVB-N,total bacteria counts,TBA and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different preservation groups

如圖8(a)表示不同保鮮處理組對羅氏沼蝦pH 的變化,pH 是評判蝦體肉質優劣與其新鮮度的關鍵指標之一[15,18]。在冷藏保鮮過程中,蝦體在自身酶和微生物的作用下,產生大量氨、三甲胺、吲哚、組胺等堿性物質[19]。有研究表明,pH 在7.6 以上則認為是消費者不可接受的值[19-21]。最優試驗組在保鮮過程中pH 明顯低于單一保鮮劑組和空白對照組,表明復合保鮮劑處理羅氏沼蝦可有效防止蝦體自溶腐敗。

圖8(b,c)中幾種不同處理的TVB-N 值和細菌總數均呈持續上升趨勢,最優試驗組明顯上升幅度更平緩,保鮮第10 d 時的TVB-N 值僅為20.57 mg∕(100 g)。通常根據淡水魚、蝦中揮發性鹽基氮的可接受值低于20 mg∕(100 g)[22]。最優試驗組能有效減緩細菌的繁殖速度,說明復合保鮮劑組具有一定的抑菌作用,有效降低細菌對蛋白質的分解,從而達到延緩TVB-N 上升的作用[21]。

圖8(d)可以看出在保鮮過程中,復合保鮮劑組＜0.3%茶多酚＜2.3%殼聚糖＜0.3%ε-聚賴氨酸,茶多酚具有較強抗氧化性,而殼聚糖由于在蝦體表面形成一層薄膜,一定程度上隔絕蝦體與外界的氧氣,因此復合保鮮均協同發揮作用,延緩脂肪氧化,延長蝦體貨架期。

圖8(e)中的感官評分也反映蝦體相同的新鮮程度,雖然復合保鮮劑組的評分并未達到預期,主要因為殼聚糖涂膜造成的蝦體表面粘連感以及茶多酚作用后導致的色澤黃暗,嗅覺上仍殘留少許醋酸和殼聚糖的混合固有氣味,在一定程度上影響消費者的可接受程度,需要后續進一步對保鮮機制的探究,從而達到更好的保鮮效果。

3 結論

采用Box-Behnken 的中心組合設計響應面法建立ε-聚賴氨酸濃度、茶多酚濃度、殼聚糖濃度與TVB-N值之間的響應面數學模型,確定了羅氏沼蝦利用ε-聚賴氨酸、茶多酚、殼聚糖復配保鮮劑冷藏(4 ±1)℃保鮮的工藝參數為:ε-聚賴氨酸濃度為0.3%、茶多酚濃度為0.3%、殼聚糖濃度為2.3%;羅氏保鮮8 d 后TVB-N 值為18.06 mg∕(100 g),回歸分析和驗證試驗表明了該響應面法具有可行性。在此條件下,羅氏沼蝦冷藏10 d 期間,TVB-N 值、TBA 值、菌落總數、pH 以及感官評分的最優保鮮試驗組均顯著優于單一保鮮劑組以及空白對照組,變化趨勢保持一致。這表明ε-聚賴氨酸、茶多酚與殼聚糖復配保鮮劑可減緩羅氏沼蝦的腐敗變質,延長貨架期至9—10 d。