左旋芳樟醇的小鼠體內抗氧化及抗皮膚衰老活性研究

陳 耕

(湖南省食品和工業產品生產許可審查中心，湖南 長沙 410000)

衰老伴隨著各種生理機能的減退，表現為行動能力減弱，抵抗力下降，記憶能力和學習能力減弱，感官能力減弱，外觀上最容易發生變化的就是皮膚。皮膚衰老表現為皮膚由光潔變為黯淡，出現老年斑，彈性降低，松弛，粗糙等[1-2]。

自由基致膠原蛋白異常氧化、交聯/斷裂、變性，使皮膚變得干燥、皺紋增多，是皮膚衰老理論中最為廣泛接受的理論之一[1]。根據這一理論，自由基清除劑、抗氧化劑可有效抗皮膚衰老。許多植物精油具有清除自由基、抗膠原蛋白氧化的活性[3]；而且，天然植物精油主要是脂溶性小分子，與細胞膜相容性好，能夠快速滲透皮膚深層[4]。此外，植物精油還具有天然環保、使用方便的優點。因此植物精油已被廣泛應用于抗皮膚衰老的藥物及護膚品中。例如：白茶精油、乳香精油是一些美肌精華的主要成分之一；芳樟油、薰衣草油、香檸檬油、玫瑰木油、天竺葵油等植物精油及紅花、川芎、香附以及干姜復方中藥精油延緩皮膚衰老的功效已被報道[5-7]。

芳樟醇是香精香料工業中最常用和用量最大的單體香料，普遍存在于芳樟油、薰衣草油、香檸檬油、玫瑰木油等芳香植物精油中。它是一種單萜，香氣佳，是配制香精香料時最受歡迎的原材料之一[8]。芳樟醇毒性低、對皮膚刺激性小，促透效果強，可促進其他成分進入皮膚[4]。Umezu等[9]研究證明，芳樟醇是薰衣草精油抗焦慮作用的主要藥理活性成分。Mitic-Culafic等[10]研究發現，芳樟醇能有效清除肝細胞HepG2和淋巴B細胞中的自由基。芳樟醇是紅花、川芎、香附、干姜等抗小鼠皮膚衰老復方中藥精油的重要功效成分[7]。李亞文[11]研究發現，茉莉、桂花、梔子花、芳樟醇均具有抗衰老活性，其中芳樟醇效果最佳。有學者[12]發現，芳樟醇的不同光學異構體的藥理效應存在差異，左旋芳樟醇催眠鎮靜作用優于消旋體和右旋體芳樟醇。左旋芳樟醇可用于防治頭痛[13]、腹痛、痛經[14]、肌肉酸痛以及舒緩疲勞等[15]。以左旋芳樟醇為主要成分薰衣草精油有較強的抗氧化[16]、催眠鎮靜[17]功效；但有關其在體內抗皮膚衰老作用的研究尚未見報道。

研究擬以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，涂抹或注射左旋芳樟醇乳液，監測小鼠自主活動情況，觀察小鼠背部皮膚皺紋分布，測定小鼠血清和皮膚勻漿的超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及皮膚勻漿羥脯氨酸(Hyp)含量等表征機體氧化、老化情況的指標，探討左旋芳樟醇的體內抗氧化、抗皮膚衰老活性，以期為左旋芳樟醇的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

左旋芳樟醇：>98%(色譜純)，廈門牡丹香華實業有限公司；

聚乙二醇-200：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

維生素E(VE)：國藥準字H35020242，國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；

雌性小鼠：健康瑞士種(ICR品系)，體重30～45 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司；

自發活動視頻分析系統：ZH-ZFT型，淮北正華生物儀器設備有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油制備 左旋芳樟醇以聚乙二醇-200為溶劑稀釋成質量分數分別為2.5%，5.0%，7.5%，分別作為低、中、高劑量精油；以聚乙二醇-200為溶劑，將VE稀釋至質量分數為10.0%。

1.2.2 動物分組、給藥 參照文獻[11]并修改：健康小鼠75只，隨機分為5組，分別為對照組、左旋芳樟醇精油組(低、中、高劑量組)、VE組，每組15只。試驗前用剃毛器剃去小鼠兩肩胛之間皮膚上的毛3 cm×3 cm。每天注射1.5 mg/g的D-半乳糖，連續注射30 d；對照組每天涂抹聚乙二醇-200，左旋芳樟醇組、VE組每天分別涂抹相應的藥物，涂抹量均為1 mL/d，連續涂抹30 d。

1.2.3 小鼠的自主活動情況 第30天，末次處理1 h后，采用自發活動視頻分析系統測定各組小鼠的自主活動情況。測定前8 h禁食禁水，將小鼠移入分析裝置中，適應3 min，然后記錄小鼠5 min內的自主活動情況，通過休息次數、休息時間以及總路程來表征小鼠的自主活動情況。

1.2.4 血清及皮膚勻漿的制備 第30天，末次處理2 h后，摘眼球取血，脫臼處死，迅速取背部脫毛處皮膚，生理鹽水沖洗后用濾紙吸去水分，-20 ℃保存，用于制作皮膚組織勻漿。

(1) 血清制備：眼球血700 r/min離心10 min，取上層血清備用。

(2) 皮膚勻漿制備：取皮膚組織0.5～1.0 g，冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液、皮下脂肪和結締組織，濾紙拭干，稱取0.5 g，加入9倍生理鹽水，用眼科小剪刀盡快剪碎，用內切式組織勻漿機勻漿(冰浴)，并反復凍融3次(-20 ℃2 h，常溫1 h)，使細胞破碎，700 r/min離心15 min，取上清液備用[13]。

1.2.5 SOD活力、MDA含量及Hyp含量測定 參照試劑盒說明書。

1.2.6 皮膚水分測定 切取1 cm2頸部涂抹精油區域皮膚，精密稱其濕重，80 ℃烘干12 h，稱其干重。

1.2.7 小鼠皮膚拍照 小鼠摘除眼球之前，采用數碼相機ISO800微距拍攝小鼠背部已脫毛皮膚照片，對比分析皮膚紋理、皺紋深度、黃褐斑分布等。

1.2.8 統計分析 應用SPSS 17.0軟件處理數據，組間差異分析采用t檢驗法。

2 結果與分析

2.1 對小鼠自主活動的影響

由表1可知，與對照組相比，精油涂抹組小鼠的休息次數、休息時間減少，總路程增加。其中精油中、高劑量組、VE組的休息次數與對照組相比差異顯著(P<0.05)，精油中劑量組總路程與對照組相比差異顯著(P<0.05)。表明左旋芳樟醇和VE均能提高衰老小鼠的活動能力，具有抗衰老活性。

表1 左旋芳樟醇精油對衰老模型小鼠自主活動的影響?

2.2 小鼠血清、皮膚SOD活力、MDA含量

由表2可知，與對照組相比，左旋芳樟醇組、VE組血清、皮膚SOD活力上升、MDA含量下降，且差異顯著(P<0.05)，表明小鼠皮膚涂抹左旋芳樟醇、VE能提高血清、皮膚SOD活力，降低MDA含量，與黃玲玲等[7]的研究結果一致。VE具有清除皮膚中自由基，降低MDA含量，延緩皮膚衰老的活性，與韓光[18]的研究一致。

MDA是脂質氧化的標志性產物，廣泛用于表征體內氧化狀態；芳樟醇處理可顯著降低衰老小鼠血清、皮膚中MDA含量，表明芳樟醇在體內具有抗氧化活性。精油可通過直接清除H2O2、羥自由基、超氧化物、超氧陰離子等一系列自由基，也可通過提高抗氧化酶的表達[19-20]，如SOD等發揮抗氧化活性。試驗表明，芳樟醇可顯著提高衰老小鼠血清、皮膚組織中SOD酶活性。

表2 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠血清、皮膚SOD活力、MDA含量的影響?

2.3 小鼠皮膚水分含量及Hyp含量

羥脯氨酸(Hyp)是膠原蛋白中的一種主要且含量穩定的氨基酸，約占13%，可用Hyp含量或其7.46倍代表皮膚膠原含量。膠原含量隨皮膚衰老而下降，因此可通過測定Hyp含量來表征皮膚衰老情況[21]。由表3可知，與對照組相比，精油組、VE組小鼠皮膚中Hyp含量均顯著增加(P<0.05)。黃玲玲等[7]研究發現，精油可使衰老小鼠皮膚Hyp含量極顯著升高(P<0.01)。皮膚老化過程中，Hyp合成減少與真皮乳頭層的微血管發生萎縮，血流量減少有關[22]；芳樟醇精油改善皮膚的微循環[23]，可促進皮膚組織合成Hyp[24]，且Hyp合成減少還與真皮中羥化酶失活有關[25-26]，自由基及脂質過氧化產物MDA的攻擊是羥化酶失活的重要原因。試驗表明，左旋芳樟醇在體內抗氧化活性較強，可清除MDA，有利于保護羥化酶合成Hyp。

由表3可知，左旋芳樟醇可顯著提高衰老小鼠皮膚的水分含量(P<0.05)。皮膚中親水性蛋白質含量及蛋白質氧化狀態是決定皮膚水分含量及保水性的重要因素。皮膚中Hyp親水性很強，其合成量減少，皮膚水合能力下降；蛋白質在自由基及脂質氧化產物(如MDA)作用下，親水基團(如半胱氨酸的巰基，賴氨酸、精氨酸的氨基等)轉化成疏水性羰基或發生交聯，皮膚水合能力下降[27]。芳樟醇精油在體內具有顯著抗氧化活性及顯著提高皮膚Hyp含量，因此其皮膚水分含量也顯著提高。

2.4 左旋芳樟醇精油對小鼠皮膚表觀的影響

由圖1可知，對照組、精油低劑量組皮膚粗糙有鱗屑，皺紋粗亂；精油中、高劑量組及VE組小鼠皮膚更加光滑、飽滿，未見明顯皺紋，老化情況明顯改善。真皮膠原的流失，角質層變薄，皮膚組織水分減少，細胞皺縮、組織萎縮等是皮膚皺紋產生的主要原因[28]；芳樟醇精油可顯著提高皮膚水分和Hyp含量，因此能明顯抑制皺紋的產生。

表3 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠皮膚水分及Hyp含量的影響?

圖1 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠皮膚皺紋的影響

在大鼠模型紫外線UV-B(280～320 nm)急性損傷試驗中，芳樟醇可顯著緩解皮膚增生、水腫形成、脂質過氧化，顯著抑制環氧酶-2(COX-2)、鳥氨酸脫羧酶活性；在UV-B長期損傷試驗中，芳樟醇可顯著抑制NF-κB、TNF-α、IL-6、VEGF、TGF-β1、Bcl-2等增生細胞因子表達，降低腫瘤發生率[24]。在小鼠模型中，芳樟醇可有效抑制酒精致急性胃潰瘍[13]；在t-BOOH致微生物突變試驗中，芳樟醇可通過清除自由基，有效保護DNA[10]；在肺細胞中，芳樟醇顯著降低MDA含量，激活Nrf2 信號通路，顯著增加抗氧化酶的表達，并下調TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達[20,29-30]；在神經細胞中具有抗氧化、抗炎活性，從而對神經細胞具有顯著保護作用，緩解大鼠模型帕金森氏癥[31]。

3 結論

試驗表明，芳樟醇精油可顯著提高衰老小鼠自主活動能力，顯著提高小鼠皮膚中超氧化物歧化酶活力(P<0.05)，顯著降低小鼠皮膚中丙二醛含量(P<0.05)，以及顯著提高小鼠皮膚中的水分、羥脯氨酸含量(P<0.05)，使皮膚更加光滑、飽滿。因此左旋芳樟醇在體內具有較強抗氧化及抗皮膚衰老活性，抑制脂質氧化，促進羥脯氨酸合成可能是左旋芳樟醇抗皮膚衰老的機制之一，但其抗皮膚老化詳細機制尚需進一步研究。