雪蓮果葉總黃酮超聲波輔助酶法提取工藝優化及抗氧化活性研究

戢得蓉 劉松奇 熊坤艷 李 夢 胡明虎

(1. 四川旅游學院食品學院，四川 成都 610100；2. 湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

雪蓮果(Saussureainvolucrata)，菊薯的別稱，為菊科向日葵屬雙子葉草本植物[1]，其葉為對生，寬心臟形，表面粗皺，稍厚，一般在采摘雪蓮果后廢棄處理。研究發現，雪蓮果葉中含多糖、黃酮、酚酸等多種活性成分[2]，其提取物具有抑菌[3]、抗氧化[4]及降血糖[5]等作用，其中黃酮類物質與降血糖功能有明顯關系。黃酮類物質的提取和抗氧化能力是目前的研究熱點[6-7]，常見的提取方法有溶劑提取法、超臨界流體萃取法、酶法、超聲波輔助法等[6,8]，超聲波輔助酶法集合了超聲波提取法和酶法兩種提取方法的優點[9-10]，超聲波振動可以破壞細胞壁使得細胞壁軟化，引起細胞內物質的移動[11]，同時酶的加入使得總黃酮的提取具有高效性，兩者結合可以得到高效穩定的產物[12-13]。陳紅慧等[14-15]利用溶劑提取法對雪蓮果葉中的總黃酮物質進行了提取和純化研究，總黃酮提取率為53.41 mg/mL。目前未見其他關于雪蓮果葉總黃酮物質提取方法的相關報道。

黃酮類物質為天然抗氧化劑，其結構中的酚羥基可與自由基結合，終止氧化反應，以此發揮抗氧化作用，其抗氧化能力與自身結構有一定關系[16]。植物中的黃酮類物質可從葉、莖及根中提取，不同來源、不同部位的黃酮類物質的組成及所具有的抗氧化能力不同[17]。對于總黃酮或者黃酮粗提取物的潛在的抗氧化能力的常見手段有測定2,2-聯苯基-1-苦基肼基自由基(DPPH·)清除率、總還原力、羥基自由基清除率等[18-20]。對雪蓮果葉總黃酮提取物的抗氧化能力的研究目前未見報道。

試驗擬以雪蓮果葉為原料，利用超聲波輔助纖維素酶提取雪蓮果葉中總黃酮，優化提取工藝條件，并探討總黃酮提取物對DPPH·清除能力和總還原力，以期為雪蓮果葉的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

雪蓮果葉：采摘于成都市龍泉驛區；

蘆丁標準品、維生素C標準品：成都金山化學試劑；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、四硼酸鈉、混合磷酸鹽、鄰苯二甲酸氫鉀、2,2-聯苯基-1-苦基肼基：分析純，成都市科龍試劑有限公司；

纖維素酶、果膠酶：2×104U/g，河南慶飛食品配料有限公司；

木瓜蛋白酶：1×105U/g，河南慶飛食品配料有限公司；

酸性蛋白酶：8×105U/g，河南慶飛食品配料有限公司；

堿性蛋白酶：2×105U/g，河南慶飛食品配料有限公司；

中性蛋白酶：5×104U/g，河南慶飛食品配料有限公司。

1.1.2 主要儀器

電熱鼓風干燥箱：101-0型，北京中興偉業儀器有限公司；

高速連續式超微粉碎機：YJ2-2型，濟南億健醫療設備有限公司；

分析天平：FALL044型，常州市衡正電子儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：XMTD-4000型，北京市永光明醫療器械有限公司；

真空泵：SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外分光光度計：UV Bluestar A型，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪蓮果葉總黃酮的提取 選取新鮮的成熟期雪蓮果葉，清洗干凈，用鼓風干燥箱在45 ℃干燥15 h，超微粉碎后過60目篩，干燥至恒重備用。稱取1.00 g雪蓮果葉于150 mL錐形瓶內，加入乙醇溶液，攪拌均勻，200 W超聲波輔助一定時間，調節pH值，加入酶后放入恒溫水浴鍋中反應一定時間后取出，進行真空抽濾。抽濾2～3次將濾液合并倒入100 mL容量瓶，定容至刻度線，測定總黃酮提取率。

1.2.2 總黃酮的測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁顯色法[21]，得到標準曲線回歸方程為A420 nm=1.343 9C-0.005(A420 nm為吸光度；C為蘆丁標樣濃度，mg/mL)，相關系數R2=0.999 2。按式(1)計算總黃酮提取率。

(1)

式中：

X——總黃酮提取率，%；

M1——測定時樣液中黃酮的質量，mg；

V1——樣液的體積，mL；

M2——樣品的質量，g；

V2——測定時取樣液的體積，mL。

1.2.3 試驗設計

(1) 不同方法的比較：分別稱取1.00 g雪蓮果葉粉于3個錐形瓶中，加入50 mL乙醇溶液，標號1、2、3、4。按照1.2.2進行試驗：1號瓶中未做超聲波及酶處理，2號瓶中加1 mg/mL纖維素酶不做超聲波處理，3號瓶用超聲波在50 ℃下輔助10 min且不進行酶處理，4號瓶用超聲波在50 ℃下輔助10 min后加入1.0 mg/mL纖維素酶，分別測定總黃酮提取率。

(2) 酶種類的確定：探究6種酶(最適pH值，最適溫度)[纖維素酶(pH 4.8，50 ℃)、果膠酶(pH 3.5，50 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.5，60 ℃)、酸性蛋白酶(pH 3.0，40 ℃)、堿性蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)和中性蛋白酶(pH 6.9，48 ℃)]對雪蓮果葉中總黃酮提取率的影響，以1.00 g雪蓮果葉粉為底料，加入50 mL乙醇溶劑，攪拌均勻后超聲波處理10 min，加入酶且濃度為0.4 mg/mL，在對應酶的最適pH值及最適溫度下進行40 min，分別測定總黃酮提取率。

(3) 單因素試驗設計：確定基礎試驗方法為超聲波輔助時間20 min、超聲波輔助溫度50 ℃、酶質量濃度1 mg/mL、酶解時間40 min、乙醇體積分數60%、料液比(m雪蓮果葉∶V乙醇)1∶50 (g/mL)的條件下，分別考察各因素對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響。各因素水平設計見表1。

(4) 響應面試驗設計：在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的因素，以總黃酮提取率為響應值，設計響應面試驗。

表1 單因素試驗因素水平表

1.2.4 抗氧化能力測定

(1) DPPH·清除能力：參照文獻[22]，紫外分光光度計檢測波長為517 nm。

(2) 總還原力能力：參照文獻[23]，紫外分光光度計檢測波長為700 nm。

1.3 數據處理與分析

運用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法的比較

由圖1可知，與僅溶劑提取相比較，在酶和超聲波的輔助作用下雪蓮果葉總黃酮提取率明顯提高，兩者同時使用結果最優。選擇超聲波輔助纖維素酶進行進一步試驗。

2.2 酶種類的確定

由圖2可知，酶的種類對雪蓮果葉黃酮提取率的影響較大，其中纖維素酶處理所得雪蓮果葉黃酮提取率最高為5.26%，所以選取纖維素酶結合超聲輔助進行進一步試驗。

2.3 單因素試驗

如圖3所示，最佳超聲波輔助時間為12 min；最佳超聲波輔助溫度為50 ℃；最佳酶質量濃度為0.4 mg/mL；最佳料液比(m雪蓮果葉∶V乙醇)為1∶50 (g/mL)；最佳乙醇體積分數為20%；酶解時間為60 min。

圖1 方法比較結果

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果 基于單因素試驗結果，超聲波輔助時間12 min時提取率最高，隨著提取過程的進行，雪蓮果葉粉和提取溶劑間的濃度差逐漸減小，超聲波時間繼續增加可能會破壞黃酮類提取物[22]。超聲波輔助溫度在50 ℃時結果最好，與纖維素酶的最適溫度一致，選取此溫度進行下一步試驗。在酶濃度為0.4 mg/mL時總黃酮得率最高，說明在此酶濃度下纖維素酶可能已經將雪蓮果葉片細胞中的纖維素完全降解[13]。所以固定超聲波輔助時間12 min、超聲波輔助溫度50 ℃、酶質量濃度0.4 mg/mL條件下，選取料液比、酶解時間、乙醇體積分數3個因素，設計三因素三水平的響應面試驗，試驗因素及水平見表2，響應面試驗試驗結果見表3。

運用Design-Exert 10.0.4軟件對試驗數據進行分析處理，得到回歸方程為：

Y=5.34+0.37A+0.17B+0.14C+0.14AB+0.071AC-0.079BC+0.15A2-0.21B2+0.20C2。

(2)

對回歸模型進行方差分析，結果見表4，該模型極顯著(P=0.000 6<0.05)，失擬項不顯著(P=0.399 3>0.05)，說明該模型能較準確反映3個因素對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響，從F值得出各因素對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響從大到小依次為料液比>酶解時間>乙醇體積分數。校正系數R2=0.956 2，說明95.62%以上的數據能用此方程解釋，擬合度較好，可用于超聲波酶法提取雪蓮果葉中總黃酮工藝的試驗預測及分析。

圖2 酶種類對比結果

圖3 各因素對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響

表2 響應面試驗因素及水平

2.4.2 各因素交互作用分析 由圖4～6可知：料液比與酶解時間的等高線較陡峭，說明二者的交互作用明顯且料液比對總黃酮提取率的影響更大；料液比與乙醇體積分數交互作用的等高線的形狀表現接近圓形，說明兩個因素的相互影響效果不明顯；酶解時間和乙醇體積分數的等高線形成的坡面的走勢較為陡峭，說明酶解時間對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響比料液比的強，交互作用明顯。

2.4.3 驗證實驗 利用Design-Exert 10.0.4軟件優化試驗結果，得最佳工藝條件為料液比(m雪蓮果葉∶V乙醇)1∶60 (g/mL)，酶解時間65.55 min，乙醇體積分數29.67%，此條件下總黃酮提取率理論可達6.335%。考慮到實際的可操作性，將酶解時間調整為66.00 min。實際驗證實驗的條件為：乙醇體積分數30%、酶質量濃度0.4 mg/mL、料液比(m雪蓮果葉∶V乙醇)1∶60 (g/mL)、酶解66 min、在50 ℃下超聲處理12 min，實際提取率為6.317%，與理論值相對誤差為0.28%，模型預測性較好且穩定，可用于雪蓮果葉中總黃酮的提取。

2.5 雪蓮果葉總黃酮抗氧化能力

由圖7可知，在所選濃度范圍內，雪蓮果葉總黃酮粗提取物對于DPPH·有明顯的清除能力(IC50=0.25 mg/mL)。其清除能力略低于維生素C，高于紅景天、何首烏及石榴皮[24]等，表明雪蓮果葉總黃酮提取液具有較高的抗氧化活性。由圖8可知，總還原力與濃度的關系與DPPH·清除能力測定結果相似，抗氧化能力大小與濃度線性正相關，呈劑量依賴關系。說明雪蓮果葉中總黃酮粗提取物具有明顯的抗氧化效果。

表3 響應面試驗結果

表4 回歸模型方差分析?

圖4 料液比和酶解時間對總黃酮提取率的影響

圖5 料液比和乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

圖6 酶解時間和乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

圖7 雪蓮果葉中總黃酮提取液和維生素C對DPPH·清除能力的比較

圖8 雪蓮果葉中總黃酮提取液和維生素C總還原能力的比較

3 結論

超聲波輔助酶法提取雪蓮果葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數30%、酶質量濃度0.4 mg/mL、料液比(m雪蓮果葉∶V乙醇)1∶50 (g/mL)、酶解時間62 min、超聲溫度50 ℃、超聲時間12 min，該最佳工藝下雪蓮果葉中總黃酮提取率可達6.317%，高于陳紅惠等[25]報道的53.41 mg/g。體外抗氧化活性表明，在測試濃度范圍內，雪蓮果葉提取液對DPPH自由基具有較好的清除能力及較好的總還原力。試驗僅對雪蓮果葉總黃酮的抗氧化活性進行了初步探究，尚未對抗氧化成分進行定量分離，后續可對雪蓮果葉黃酮類成分進行定量分析及化學成分分析。