劉璐璐 王寶貝
(1. 福建農林大學食品科學學院,福建 福州 350002;2. 泉州師范學院海洋與食品學院,福建 泉州 362000;3. 福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發重點實驗室,福建 泉州 362000;4. 近海資源生物技術福建省高校重點實驗室,福建 泉州 362000)
藻類與人類的生活密切相關,因富含不飽和脂肪酸、多糖、多肽、維生素等營養物質,在食品和醫藥中的應用歷史久遠[1]。盡管藻類的營養豐富,但不同的藻類具有各自獨特的風味,有些藻類帶有宜人的青草香味和花香,如Staurastrtmlsp和Rapbidocelisinclinata,有些則帶有刺鼻的腥臭味,如Uroglenaamericana及Synedraacus等[2]。風味是影響藻類在食品、醫藥領域中應用的主要因素之一,如何提升藻類中宜人的氣味,消除讓人難以接受的腥臭味,是開發藻類食品需要考慮的重要因素,而風味的好壞主要由藻中揮發性物質成分和含量決定。揮發性物質(VOCs)是具有低至中等親水性,可以穿過細胞膜自由釋放到大氣中的一類小分子化合物[3]。它是決定藻類產品風味優劣的主要因素,對藻類在食品行業中的應用推廣都有重要的意義[4]。此外,藻類的揮發性物質還能實時反映微藻生長狀態[5],在防御捕食[6]和藻類的有性繁殖[5]等方面有著重要作用。
文章擬闡述藻類中揮發性物質的種類、風味及形成途徑,并對揮發性物質的不同提取方法進行分析比較,以期對今后藻類中揮發性物質的研究提供參考。
藻類所含的揮發性化合物種類繁多,主要包括醛、烴、醇、酮、硫化物、羧酸、鹵化物、酚、酯、萜烯及呋喃等。不同藻類中含有的揮發性化合物存在一定的差異,如褐藻Punctariatenuissima的揮發性物質主要為游離脂肪酸,其次為烴類[7];綠藻主要為醛類、羧酸類和酯類[8];紅藻Pterocladiellacapillacea,醛類釋放量最多(71.9%),其次為烴類(10.6%),而Osmundariaobtusiloba釋放量最多的揮發性物質為烴類(65.4%),其次為醛類(30.0%)[3]。
醛類為分子中含有醛基(—CHO)的化合物的統稱,根據醛基的數量可以分為一元醛與多元醛。藻類中的揮發性醛主要有戊醛、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、β-環檸檬醛和藏花醛等(表1)。醛類閾值普遍較低,因此對藻類風味貢獻較大[4]。與海水藻相比,淡水藻的揮發性醛類含量較低,種類也比較少(表1)。Van Durme等[4]在對藻類揮發性物質的研究中發現,醛類在海水藻Botryococcusbraunii、Rhodomonas和Tetraselmisspecies中含量最高,分別占總揮發性物質的95.67%,87.00%,91.47%,而醛類在淡水小球藻中僅占總揮發性物質的16.22%。Abdel-Baky等[9]發現醛類在小球藻中僅占3.24%。海藻中的醛種類一般在20種左右[10],而淡水藻中一般只有10種左右[4]。Lopez-Perez等[10]發現海水藻H.elongata和P.palmata中分別有22~28種醛,而淡水的P.palmata[11]和U.pinnatifida[12]則僅有7~13種醛。
不同的醛所呈現出的風味也有一定的差異,如2,4-七烯醛等C17不飽和醛,閾值較低,呈青草香,而有些不飽和醛則散發出蔬菜和魚腥味,直鏈與支鏈醛類不僅會呈青草香,還會有草木甚至辛辣的味道[1]。己醛則呈類似綠色植物的風味,己醛、庚醛、辛醛和壬醛由脂質氫過氧化物和過氧自由基的降解產生[13-14]。Yamamoto等[15]發現苯甲醛是日本Shizuoka地區Monostromanitidum中的重要揮發性物質,為水果和花卉提供甜杏仁味。
揮發性酮的閾值較低,是影響藻類風味的重要物質[4]。常見揮發性酮的種類及風味見表2。揮發性酮主要表現為果味和奶油味。比如:β-紫羅蘭酮具有水果味且氣味較濃[18],2,3-丁二酮具有奶油味和奶酪味,3-辛酮呈草藥味和堅果味,6-甲基-5-庚烯-2-酮呈甜味和水果味[13],2-庚酮為甜味、水果味和肉桂味,3-辛烯-2-酮具有果香和檸檬香,2,3-辛二酮具有奶油香和油脂香[19]。
藻類中的揮發性醇主要有1-戊醇、1-己醇、3-甲基丁醇、1-戊烯-3-醇等(表3),其含量豐富。Ferraces-Casais等[20]發現海帶和裙帶菜中的揮發性醇分別占總揮發性物質的29%和25%。大多數直鏈醇(C4~C9醇)呈類似水果香味,比如:2,3-丁二醇為水果味和洋蔥味,(E)-2-戊烯-1-醇表現為蘑菇味、甜味以及類似紅酒的味道[21],Phormidiumautumnale中的3-甲基-1-丁醇則具有威士忌、麥芽和燒焦的味道[22]。1-辛烯-3-醇在藻中有蘑菇或金屬味[23],而當其與甲氧基同時存在時則表現為土豆味[24]。
烷烴和烯烴等是藻類揮發性物質的主要成分,其含量可達總揮發性物質的50%以上。在裙帶菜Undariapinnatida和紅藻O.obtusiloba中,烴在總揮發性成分中的占比分別達到49.71%[10]和65.40%[9]。烴類在綠藻揮發性物質中的比例更高,如在日本不同地區養殖的綠藻,其烴類的占比均在80%以上[15]。藻中揮發性烴主要為C8~C18,且多以飽和烷烴含量較高[25-26],C20以上的長鏈烷烴只在少數藻類中發現[16]。Milovanovic等[27]發現螺旋藻中揮發性物質含量最多的是十五烷烴、十六烷烴和十七烷烴。其中,十七烷烴在兩種螺旋藻中占揮發性物質的比例分別為82.21%和73.12%。

表1 藻類中的常見醛類揮發性物質

表2 藻中常見酮類揮發性物質

表3 藻中常見醇類揮發性物質
雖然揮發性烴在藻類中的含量較高,但由于其閾值較高,所以其對藻類的氣味影響較小[19]。其中,龍須菜中的甲苯呈類似苯的味道,1,2,4-三甲基苯具有塑料味,1,2,3-三甲基苯具有金屬味[21]。
藻類中酸的種類豐富且含量也相對較高,如在Punctariatenuissima、Laminariaochotensis和Laminariaangustata中,酸占總揮發性物質的96.80%[7],43.86%,57.95%[28]。藻類中的揮發性酸主要有乙酸、油酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸等(表4)。酸可以提高食物的特征風味,但隨著酸鏈長度的增加,氣味強度降低。碳原子數<6的簡單酸具有較高的氣味閾值,而碳原子數≥12的長鏈酸則無氣味,且不飽和酸通常比飽和酸有更強烈的氣味[29]。比如丁酸具有酸臭味和甜味[22]、肉豆蔻酸具有強烈的奶香味、棕櫚酸具有酸奶香味,油酸和硬脂酸具有油脂味[19],戊酸則具有酸味、奶酪味和牛肉味[23]。

表4 藻中常見酸類揮發性物質
藻類中的酯類主要有棕櫚酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻酸異丙酯等(表5)。揮發性酯具有較強的氣味,一般不飽和酯的閾值比飽和酯的閾值低[29]。揮發性酯多呈水果味、甜味和花香[22]。在Ulvaprolifera、Ulvalinza以及M.nitidumde中,肉豆蔻酸甲酯(十四酸甲酯)具有蜂蜜味和花香[15];小球藻等微藻中的辛酸甲酯為新鮮水果味[23];Ulvapertusa中的亞麻酸甲酯為甜瓜味[15]。棕櫚酸甲酯是石莼中的主要酯類,為海藻提供甜味和水果味[8]。

表5 藻中常見酯類揮發性物質
除了以上介紹的揮發性物質外,藻類中的揮發性物質還含有鹵代烴、硫化物和萜烯等。這些揮發性物質在藻類中含量較少,種類簡單,但對藻類風味也有一定的貢獻。藻類中常見的鹵代烴包括二氯甲烷、三氯甲烷、六氯乙烷、碘乙烷、三溴甲烷、氯苯等,其形成與藻類的生長環境有關[30]。硫化物在藻類中種類較少,但其閾值較低,因此對風味具有一定影響[21]。藻類中的揮發性硫化物主要有二甲基硫醚、二甲基三硫化物、4-甲基苯磺酰胺和甲苯磺丁酰胺等。二甲基硫醚具有硫磺、卷心菜和西紅柿的味道[31]。二甲基三硫化物在濃度較高時呈肉味和熟洋蔥味[4],也有學者[21, 31]認為二甲基三硫化物還有蒜味、腐爛的味道、金屬味、綠色蔬菜的味道。
萜烯類揮發性物質是許多陸生植物中重要的揮發性化合物,在藻類中濃度較低[7]。藻類中萜烯類揮發性物質主要有植物醇、六氫法呢基丙酮和姥鮫烷。小球藻中的植物醇源于葉綠素的降解,Lafarge等[32]研究發現小球藻中植物醇質量濃度高達4 073 μg/L,但味道很淡基本無法嗅到。
藻類中的短鏈和中鏈醛主要源自于脂肪酸[8]。一般認為植物中的短鏈醛(C6,C9)主要來自C18不飽和脂肪酸的氧化降解,而海洋魚類中的短鏈醛則主要來自長鏈不飽和脂肪酸(C20,C22),藻類同時存在以上兩種短鏈醛的形成途徑。中鏈醛(C10)一般由長鏈脂肪酸(C20)斷裂形成的,而長鏈醛(C15,C17)則是在脂肪酸生成2-氫過氧酸的過程中形成的[6],其中,C17不飽和醛主要通過脂氧化酶作用于不飽和(C18)脂肪酸產生[1]。
脂質氧化產物還包含一些直鏈烷醛、甲基烷醛、2-烯醛和二烯烷醛等,如(E,Z)-2,6-壬二烯醛來自于n-3不飽和脂肪酸的降解,在食物中散發黃瓜味;2,4-癸二烯醛源于n-6脂肪酸的自氧化,也可以進一步氧化為己醛和2-辛烯醛。而苯甲醛和甲基丁醛來自于氨基酸的Strecker降解反應。除了脂肪酸與氨基酸,β-胡蘿卜素也是醛類的來源之一,如β-環檸檬醛就是由β-胡蘿卜素的C7和C8之間的雙鍵被酶裂解產生[22]。
藻類中的揮發性酮主要來自不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和氨基酸的氧化、降解[33-34]。Le Pape等[11]發現PalmariaPalmatae中的3-辛酮來自脂肪酸的氧化。6-甲基-5-庚烯-2-酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮主要來自番茄紅素、八氫番茄紅素等類胡蘿卜素的氧化降解[24]。β-胡蘿卜素在C9和C10之間的雙鍵裂解可以得到β-紫羅蘭酮[22]。此外,海藻曬干過程中會導致β-胡蘿卜素熱降解產生2,2,6-三甲基環己酮、2,6,6-三甲基-2-羥基環己酮、5,6-環氧環離子酮和二氫內酯[15]。然而,當前對揮發性酮在藻類中的形成研究還不夠全面,有些酮的來源仍存在爭議。Yaylayan等[35]認為具有餅干風味的2,3-戊二酮是由L-丙氨酸的2個碳原子和葡萄糖的3個碳原子通過美拉德反應而得的。然而,Le Pape等[11]在新鮮的紅藻P.palmata中檢測到了2,3-戊二酮,因此他認為2,3-戊二酮是鮮藻的代謝產物。
藻類中的醇主要來自不飽和脂肪酸的氧化[22]。比如,1-辛烯-3-醇來自n-6多不飽和脂肪酸的降解,1-辛醇來自n-9多不飽和脂肪酸氧化分解[24],(E)-2-戊烯-1-醇來則由n-3多不飽和脂肪酸氧化而得[23-24]。亞油酸和亞麻酸在脂肪氧化酶和過氧化氫裂解酶的還可以裂解生成六碳醇[36]133-134。此外,部分醇來自葡萄糖的分解,如3-甲基-1-丁醇與異丁醇[37]。葡萄糖經磷酸戊糖途徑得到丙酮酸,丙酮酸通過2-酮酸途徑得到2-酮異戊酸酯,2-酮異戊酸酯經過一系列的反應分別得到3-甲基-1-丁醇和異丁醇(圖1)。
揮發性烴在藻類中種類較多,其來源也較廣。烴類可以通過烷基自由基的自氧化過程或類胡蘿卜素分解過程形成,如十七烷烴來自β-胡蘿卜素的熱降解[34]、辛烷和十一烷主要來自不飽和脂肪酸[38]、1,3-(E)-5-(Z)-辛三烯來自于n-3脂肪酸的降解[11]。辛烷和癸烷在海洋褐藻中起到性激素的作用,可以由C20不飽和脂肪酸通過9-氫過氧化物、酶解和重排形成[39]。一些短鏈烴如乙烷、乙烯和戊烷是脂質過氧化的產物[39]。

圖1 異丁醇和3-甲基-1-丁醇合成途徑[5]
揮發性鹵代烴的來源之一是單鹵代和二鹵代脂肪酸的水解[40];也有研究[41]表明揮發性鹵代烴的形成可能是由于清除藻類細胞中的強氧化劑,如次氯酸鹽和過氧化氫。
二甲基硫醚是大部分海洋藻類的特征風味物質[4, 23],有學者[5]認為二甲基硫醚是二甲基巰基丙酸在二甲基巰基丙酸裂解酶的作用下的產物,而二甲基巰基丙酸是甲硫氨酸在甲硫氨酸脫羧酶的作用下,經過脫羧、氧化及甲基化得到(圖2)。有學者[42]稱甲硫醇是二甲基硫醚和二甲基三硫化物的前體物質,也有文獻[36]138報道甲硫醇是甲硫氨酸降解的產物,可以進一步被氧化成硫酯或硫醚等硫化物。
植物萜烯類揮發性物質通常有兩種合成途徑:甲羥戊酸途徑(MVA)和質體非甲羥戊酸途徑(DXP),其中類異戊二烯合成的基礎物質為異戊烯二磷酸(IPP)和異戊烯丙基二磷酸(DMAPP)[43-45](圖3)。MVA途徑是合成倍半萜、甾醇和多萜的主要途徑,而DXP途徑是合成單萜的主要途徑。

圖2 二甲基硫醚合成[5]

DXS. 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 DXR. 異構酶 CMS. 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶 CMK. 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶 MCS. 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環二磷酸合酶 HDS. 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶 HDR. 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶 IDI. 異戊烯基焦磷酸異構酶 ISPS. 異戊二烯合成酶 GPPS. 香葉基二磷酸合成酶GPP. 香葉基二磷酸 ATOT. 乙酰乙酰輔酶A硫解酶 HMGS. 羥甲基戊二酰輔酶A合酶 HMGR. 羥甲基戊二酰輔酶A還原酶MVK. 甲羥戊酸激酶 PMK. 磷酸甲戊酸激酶 MDD. 甲羥戊酸焦磷酸脫氫酶 FPP. 法尼酰二磷酸 GGPP. 香葉基香葉基焦磷酸
揮發性物質的分離鑒定一般采用氣相色譜—質譜聯用技術(GC-MS)。其提取方法主要包括同時蒸餾萃取法、液—液萃取法、動態頂空提取法和固相微萃取技術(或頂空固相微萃取技術)[46]。不同提取方法對同一種藻提取得到的揮發性物質存在一定的差異,如Lafarge等[32]分別使用固相微萃取法和超聲輔助液—液萃取法對小球藻中的揮發性成分進行研究,發現固相微萃取法得到的揮發性物質中醛類含量最高,而超聲輔助液—液萃取法則是以萜烯類為主,兩種提取方法所得揮發性物質僅有一種共同物質β-紫羅蘭酮。不同的提取方法有各自的特點,也各有優缺點,幾種常見的揮發性物質提取方法的特點及優缺點見表6。
同時蒸餾萃取法(Simultaneous distillation extraction,SDE)通過對樣品的反復蒸餾和萃取,從而使樣品中的揮發性物質得到濃縮,再進行氣相色譜—質譜聯用進行分離鑒定。SDE法適用于提取高沸點、低揮發性的物質,其優點在于能對樣品中低濃度的揮發性物質進行濃縮[50]。采用SDE法需要的樣品量較多,王麗娟等[51]采用同時蒸餾萃取法對杜氏鹽藻進行揮發性成分分析,需杜氏鹽藻粉10 g;而宋紹華等[52]在對滸苔進行揮發性成分進行分析時,采用固相微萃取法進行提取,則只需滸苔0.08 g。
Sun等[18]利用同時蒸餾萃取法(SDE)和靜態真空同時蒸餾萃取法(V-SDE)分別對100 g新鮮藻進行揮發性物質成分研究。其中同時蒸餾萃取法是將100 g綠藻切成5 cm的小段,放入5 L的圓底燒瓶中,加入2 L雙蒸餾水,再加入1 mL 2,4,6-三甲基吡啶作為內標(即蒸餾水中10 μg/mL),加入50 mL重蒸餾乙醚萃取,萃取時間為3 h。利用氮氣(純度99.99%)使提取物濃縮至10 mL,用無水硫酸鈉進行干燥,再進一步濃縮至0.2 mL,-80 ℃保存備用。而靜態真空同時蒸餾萃取法是將100 g新鮮藻和600 mL重蒸餾水混合在2.5 mL的燒瓶中,同樣加入1 mL 2,4,6-三甲基吡啶作為內標,加入3 mL異辛烷在真空下萃取3 h,裝置在加熱前利用真空泵進行抽真空。結果表明SDE檢測到的醛類比V-SDE的多15種,尤其長鏈醛,只有SDE法檢測到,而V-SDE法檢測到的酮類多于SDE法。SDE適用于高沸點揮發性物質的提取,在此過程中可能會造成一些物質的熱降解,而V-SDE法彌補了這一缺陷。
液—液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)常以超聲輔助,樣品與萃取劑、內標物混合,超聲后將懸浮液離心,上清液進行脫水、過濾、濃縮后,采用氣相色譜—質譜聯用對濃縮后的萃取物進行分離鑒定。Lafarge等[32]利用超聲輔助LLE法對小球藻中的揮發性成分進行分析研究,將5 g藻樣、25 mL萃取劑(摩爾比為59.55/40.45的共沸物“丙烷-2-酮/環戊烷”)和100 μL內標物強烈攪拌5 min,再將燒瓶置于超聲10 min,超聲后立即取出懸浮液離心,離心后取上清液,并用硫酸鈉脫水,提取物過濾后濃縮,利用GC-MS對濃縮液進行分析。研究發現LLE法適用于沸點較高且閾值較高的揮發性物質。若溶劑選擇恰當,LLE法只需一步就可以將目的揮發性物質全部提取[32]。然而,LLE法需要大量的萃取溶劑,且這些溶劑多數有毒,處理比較困難[50]。LLE法相比于同時蒸餾萃取和固相微萃取法,測定所需樣品中揮發性物質濃度較高[53]。
動態頂空提取法(Dynamic headspace extraction,DHE)是一種氣體取樣方法,通過惰性氣體(通常為氦氣)的連續流動,使揮發性物質被吸附在吸附劑上,載氣從容器中循環或從容器中吹出,從樣品中分離出揮發性成分,在進行GC-MS分析之前需要進行熱脫附[46]。這種方法不需要對初始產物進行加熱,適用于沸點較低的揮發性物質[11]。Takahashi等[28]使用動態頂空提取法對海帶中的揮發性物質進行收集,然后采用SDE法進行分離,再使用氣相色譜—質譜聯用對揮發性物質進行鑒定,得到3種海帶的揮發性物質分別為47,49,41種。

表6 幾種常見揮發性物質提取方法
Lepape等[11]采用DHE法提取紅藻P.palmata的揮發性物質,先對藻進行破碎,使用吹掃捕集器,在60 mL/min 下用氦氣吹掃樣品的頂部空間,并在25 ℃下掃入多孔吸附劑聚合物,揮發性化合物在-40 ℃下使用二氧化碳進行冷聚焦,并通過在195 ℃下加熱捕集器進行熱解吸,最后利用氣相色譜—質譜聯用對揮發性物質進行分離鑒定,共得到揮發性物質23種,包括醛類7種,鹵化物7種,烴類4種,醇類3種和酮類2種。
固相微萃取法(Solid-phase microextraction,SPME)的概念最早由Belardi和Pawliszyn在1982年率先提出,隨后由Pawliszyn及其同事繼續發展了這一概念[50]。SPME技術利用“相似相溶” 的原理,依賴裝置中的纖維萃取頭對揮發性物質進行吸附,再將萃取頭放置于氣相色譜進樣口進行高溫解吸,利用氣相色譜—質譜聯用對所解析的揮發性物質進行分離鑒定。SPME適用于揮發性和半揮發性的物質[11]。Lafarge等[32]研究發現,SPME更適合于沸點<160 ℃的揮發性物質。SPME具有操作簡便快速、樣品需求量少、應用廣泛等優點[49]。近年來,越來越多的學者采用此法對揮發性物質進行研究。如Hosoglu等[23]采用固相微萃取法對3種海水微藻和2種淡水微藻進行揮發性物質和氣味的研究,鑒定了21種芳香活性物質,另外有6種無法鑒定。
張敏等[55]利用頂空固相微萃取法分別對鼠尾藻、滸苔、龍須菜、紅毛菜和條斑紫菜進行揮發性物質的提取,再利用氣相色譜—質譜對揮發性物質進行分析。頂空固相微萃取法只需0.3 g風干粉碎的藻樣,將其放入15 mL固相微萃取頂空瓶中進行水浴,水浴后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中萃取0.5 h,靜置10 min后立刻將萃取頭放置在進樣口解吸,利用氣相色譜—質譜聯用對揮發性物質進行分析。采用此法鑒定出鼠尾藻中揮發性物質共29種,滸苔中22種,龍須菜中29種,紅毛菜中32種,條斑菜中28種,其中烴類在5種藻中種類最多。固相微萃取法在提取揮發性物質過程中所需樣品量少,用時短,并且無有機溶劑參與,因此提高了分析速率,保障了環境安全。
當前,藻類揮發性物質的提取方法還是基于以上幾種食品常用的提取方法,要更好地了解和分析藻類揮發性物質的組成特點,除了清楚各種方法的優缺點外,還應根據試驗目的充分考慮傳統提取方法是否能夠將藻類特有的揮發性物質提取出來。比如,微藻的尺寸小且細胞壁堅硬,使用傳統方法提取前,先進行破壁處理,有利于使揮發性物質提取完全。此外,溶劑的選擇也是至關重要的。
藻類獨特的風味主要是由其揮發性物質成分決定。合理設計脫腥方案可以將藻類中的腥臭味物質脫除,從而使藻類能夠更好地應用于產品中。此外,了解藻類中的揮發性物質特別是風味物質的形成途徑,將有利于今后采用培養條件優化或基因工程等方法提高藻類目的風味物質的含量。
當前關于絕大多數揮發性物質的形成機制還不是很清楚。若能對藻類揮發性物質的形成機制有更深入的了解,將為今后從源頭調節藻類揮發性物質的形成提供理論依據。藻類揮發性物質的研究,提取方法的選擇也非常重要。開發一種快捷、簡便、靈敏,且能夠更全面地將藻類中揮發性物質提取出來的方法是促進揮發性物質研究的關鍵。