p53在層流剪切應力下對EPCs分化及功能的影響*

王美月， 賀燕婷， 于 潔， 崔曉棟， 成 敏， 張曉蕓

（濰坊醫學院基礎醫學院，山東濰坊261053）

目前心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）占據人類死因的首位［1］，內皮損傷與修復的失衡導致的內皮功能障礙是眾多心血管疾病的主要原因［2］。內皮損傷可通過損傷部位附近內皮細胞的局部遷移和增殖，或通過祖細胞的動員并加入損傷部位來修復。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）存在于循環系統中，當血管產生損傷時，EPCs由骨髓動員到受損部位，通過增殖并向內皮細胞分化參與受損血管的內皮修復，在參與及維持血管的正常功能中起著重要作用［3-4］。EPCs 因為其較高增殖、遷移以及血管形成能力成為了再生心血管醫學治療內皮損傷以及缺血性損傷的有效工具及重要靶點［5］。

剪切應力（shear stress，SS）是由血管壁上血液流動產生的流體動力，在維持內皮穩態中起著重要作用［6-7］。文獻及我們前期的實驗表明，血流產生的剪切應力能對EPCs 分化及血管修復能力起調節作用，穩定的層流剪切應力（laminar shear stress，LSS）會促進內皮祖細胞向內皮細胞分化并增強其血管修復能力［8-9］，但具體機制并不十分明朗。

p53 在細胞內的生物學功能主要是對外界各類應激原產生應答，啟動損傷的DNA 修復，維持基因組的穩定，因此p53 曾被稱為“基因組衛士”。近年來，隨著研究的深入，人們發現p53 還參與眾多細胞的分化與轉分化。Lin 等［10］的實驗表明，LSS 可以通過p53 調節內皮細胞的凋亡，維持血管內皮的穩定。LSS 是否能夠通過p53 調節EPCs 的功能及分化尚未見報道。本研究主要探討了LSS 通過p53 對EPCs 功能及分化的影響，以期探尋潛在的生物靶點分子。

材料和方法

1 主要試劑和材料

SD 大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁殖中心，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。EGM-2MV 培養基（Lonza）；M199 培養基和Trizol 試劑（Invitrogen）；纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、Histopaque-1083 淋巴細胞分離液和FITC-UEA-1（Sigma）；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（Hyclone）；Matrigel（BD）；pifithrin-α（Selleck）；DiI-Ac-LDL（上海懋康生物科技有限公司）；vWF 酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；CCK-8 檢測試劑盒（Dojindo）、EdU 檢測試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；抗p-p53 抗體、抗p53 抗體、抗CD31 抗體和抗vWF 抗體（Abcam）；抗CD45抗體（Cyagen）；抗血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor recep?tor 2，VEGFR2）抗體（Cell Signaling Technology）。

2 主要方法

2.1 骨髓單個核細胞分離、培養與晚期EPCs 的鑒定 將大鼠頸椎脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡10 min，然后將大鼠四肢剪下，放在含有75%乙醇的平皿中，超凈工作臺中剃去肌肉組織，剪去四肢長骨兩端骨骺，反復吹打直至骨髓腔變白。將獲得的細胞懸液離心、清洗并重懸，加到密度梯度離心液上方，離心后吸取中間層云霧狀細胞，用PBS 清洗3 次，最后一次清洗完畢之后加入EGM-2 培養基誘導培養，5 d 后換液，以后每隔3 d 更換培養液。本實驗采用晚期EPCs（3～4代細胞）作為研究對象。

待細胞傳代至3 代以后，將細胞消化接種至24孔板中。將DiI-Ac-LDL 按5 mg/L 加入24 孔板中，置于37℃培養箱中孵育5 h，培養液吸出，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，按500 mg/L 加入FITCUEA-1置于37℃培養箱孵育2 h，PBS清洗，熒光顯微鏡下拍照。采用流式細胞術檢測晚期EPCs 細胞表面標志物CD45、CD31、vWF及VEGFR2的表達。

2.2 實驗分組 選取3～5 代的大鼠EPCs，分為：（1）LSS 組：施加12 dyn/cm2的LSS 處理細胞，檢測相關指標；（2）LSS+pifithrin-α 組：在培養基中加入pifithrin-α（10 μmol/L）并施加12 dyn/cm2的LSS 處理細胞，檢測相關指標。

2.3 LSS 的加載 LSS 系統（Flexcell）由蠕動泵、流室系統、儲液瓶及導管組成。將細胞接種于用FN 打底的專用載玻片上，待細胞生長至80%左右將其放于無菌處理的流動腔系統中，連接裝置。蠕動泵帶動培養基構建層流剪切應力裝置，通過計算機控制力學加載系統，設置12 dyn/cm2的LSS 作用于細胞。整個裝置置于37℃、5%CO2的培養箱中。

2.4 Western blot實驗 細胞經不同處理之后，取下載玻片，放在4 孔板中，PBS 洗2 次，將殘余PBS 用吸水紙吸凈；加入蛋白裂解液裂解細胞，蛋白收集完之后用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，進行蛋白定量。用5%濃縮膠以及10%的分離膠進行蛋白樣品的分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上封閉，分別用抗pp53（1∶500，兔源）和p53（1∶1 000，兔源）、β-actin（1∶2 000，兔源）的Ⅰ抗孵育過夜，次日用1× TBST 洗5次，加入Ⅱ抗（1∶2 000，羊抗兔）孵育，在ECL 化學發光儀上顯影并記錄數據。

2.5 RT-qPCR 細胞經不同條件處理之后，用PBS洗2次，吸去殘余液體，加入1 mL Trizol裂解細胞，提取總的RNA，逆轉錄成cDNA，再用RT-qPCR 法擴增相應的目的基因，將GAPDH 作為參照，引物序列見表1。以2-ΔΔCt公式計算相關基因的相對表達改變。

2.6 流式細胞術 胰酶消化收集細胞，PBS 洗2次，1 500 r/min 離心5 min，棄上清；加入抗CD31（或CD45）抗體室溫孵育1 h，洗滌后加入熒光標記的Ⅱ抗，4℃避光孵育1 h，PBS再次洗滌后上機檢測；vWF（或VEGFR2）染色時，先用4%多聚甲醛中固定10 min，離心，加入0.2%的吐溫破膜，而后洗滌加入vWF（或VEGFR2）I 抗室溫孵育1 h，加入熒光標記的Ⅱ抗，4℃孵育1 h，上機檢測。

2.7 ELISA 檢測 收集流槽系統中的上清，置于凍干機凍干20 h，取出凍干粉末，加2 mL 的培養基溶解，4℃、1 000×g 離心20 min，取上清檢測，具體步驟按照大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）酶聯免疫吸附測定試劑盒操作。

2.8 體外成管能力檢測 將預冷24 h 的Matrigel基質膠按每孔80 μL 的量接種到96 孔板中，放置于37℃、5% CO2的培養箱中膠化1 h，將處理后的EPCs按每孔2×104的細胞量接種到已固化處理的基質膠上，顯微鏡下觀察不同時點細胞體外成管形成情況。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 細胞遷移 胰酶消化細胞并制成細胞懸液，調整細胞密度至3×104。在Boyden 小室的下室加滿培養液，中間放8 μm 濾膜，上室懸空滴加200 μL 細胞懸液，蓋上蓋玻片，將小室放于37℃、5% CO2的培養箱中培養8 h。取下濾膜，用棉簽輕輕擦去上層未完全遷移的細胞，反向放置在12 孔板中，1×PBS 清洗，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI 染核15 min，避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照，計數細胞遷移量。

2.10 CCK-8 法檢測細胞活力 將處理組的EPCs用胰酶消化，按每孔2×104細胞量加入96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，對數生長期時取出，加入CCK-8 檢測緩沖液，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，在450 nm 處檢測每孔的A 值，計算細胞活力。

2.11 EdU 染色法檢測細胞增殖 將不同處理之后的細胞，消化制成細胞懸液，按每孔1×104個細胞量接種于96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞長至對數生長期時，按1∶1 000 的比例每孔加入100 μL 的EdU 溶液，培養2 h 后棄培養基，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定液，固定30 min，棄固定液，每孔加入50 μL 的2 g/L 的甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液，PBS 清洗3 次，每孔加入100 μL 的0.5% Triton-X 孵育10 min，1×PBS 洗1次，每孔加入100 μL 的1× Apollo?染色反應液，避光孵育30 min，棄染色液，加入100 μL 的甲醇，清洗1～2 次，1×PBS 洗1 次，加入100 μL 的DAPI 染色液，避光染色15 min，棄染色液，1×PBS洗，熒光顯微鏡下觀察并根據EdU 顯色和細胞核熒光量，計算細胞增殖率。

2.12 細胞黏附的檢測 經過不同處理的細胞消化，制成細胞懸液。按每孔2×104個細胞量加入12孔板中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養30 min，取出后PBS洗3次，洗去未貼壁細胞，顯微鏡下拍照。

3 統計學處理

實驗數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。以上實驗均獨立重復3 次以上，實驗數據使用均數±標準差（mean±SD）來表示，兩組數據采用Student t檢驗分析，多組實驗數據采用多因素方差分析（oneway ANOVA）處理數據，以P＜0.05 差異具有統計學意義。

結 果

1 EPCs的鑒定

晚期EPCs形態呈鵝卵石樣或紡錘形（圖1A），具有血管形成能力（圖1B）；DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-1熒光染色后，呈染色雙染陽性的細胞認為是正在分化的EPCs（圖1C）。流式細胞術鑒定結果顯示，晚期EPCs中CD31、vWF以及VEGFR2內皮標志分子表達呈陽性，CD45表達陰性（圖1D）。

2 LSS對EPCs中p53及p-p53蛋白水平的影響

12 dyn/cm2的層流剪切應力作用于EPCs 后，Western blot 檢測p-p53 和總p53 的蛋白水平。結果顯示LSS 作用3 h 后，p53 總蛋白水平的差異無統計學顯著性，6 h 與12 h 后總p53 蛋白表達量有明顯升高（P＜0.01），見圖2A。p-p53 蛋白水平在LSS 處理30 min 和1 h 后增加，在30 min 時升高最明顯（P＜0.01），見圖2B。

3 p53在層流剪切應力促EPCs分化中的作用

與單純的LSS 相比，LSS+pifithrin-α 組內皮標志分子CD31 和vWF 的mRNA 表達降低（P＜0.01），見圖3A。CD31 蛋白表達量較單純LSS 組也明顯下降，但流式細胞術分析結果顯示LSS處理對EPCs上vWF蛋白的表達量無影響，見圖3B。鑒于vWF 為分泌型蛋白，我們進一步檢測了流槽液上清中vWF 的分泌情況，結果顯示LSS+pifithrin-α組上清液中vWF較單純LSS組明顯降低（P＜0.01），見圖3C。

4 p53在LSS對EPCs增殖及活性影響中的作用

Figure 1. Identification of late EPCs. A：the morphological changes of late EPCs（scale bar=200 μm）；B：the ability of tube forma?tion（scale bar=200 μm）；C：fluorescence staining of FITC-UEA-1 binding and DiI-Ac-LDL uptaking（scale bar=20 μm）；D：the expression of CD31，vWF，VEGFR2 and CD45 detected by flow cytometry.圖1 晚期EPCs的鑒定

Figure 2. Effects of LSS on the protein levels of p-p53 and p53. A：effect of LSS on the protein levels of p53 at 0，3，6 and 12 h；B：effect of LSS on the protein levels of p-p53 at 0，10 min，30 min，1 h and 2 h. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 0 h group.圖2 LSS對p-p53以及p53蛋白水平的影響

與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EdU 陽性率增高（P＜0.05），見圖4A；CCK-8 細胞活力實驗也顯示，其細胞活力增加（圖4B），與EdU 實驗結果一致。以上檢測結果均顯示，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的增殖活性高于單純LSS組。

5 p53 在LSS 對EPCs 黏附、遷移和成管能力影響中的作用

EPCs 的黏附、遷移和成管是決定其內皮修復的基本能力。我們前期研究顯示，LSS 可促進EPCs 黏附、遷移和體外成管能力。在本實驗中我們發現，與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的黏附（圖5A）、遷移（圖5B）和成管能力（圖5C）均降低。

Figure 3. Role of p53 in differentiation of EPCs under LSS. A：the mRNA expression of CD31 and vWF after pretreatment with pifithrin-α under LSS；B：the protein expression of CD31 and vWF in EPCs treated with pifithrin-α under LSS；C：the pro?tein level of vWF in medium after pretreatment with pifithrin-α under LSS. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs static group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LSS group.圖3 p53在LSS促EPCs分化中的作用

Figure 4. The effect of p53 on proliferation of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on proliferation of EPCs under LSS tested by EdU staining（scale bar=50 μm）；B：effect of pifithrin-α on viability of EPCs under LSS tested by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖4 p53在LSS下對EPCs增殖的影響

討 論

當血管發生損傷時，EPCs 通過骨髓動員到血液循環當中，進而趨化、黏附到損傷部位，并向內皮細胞分化，代替損傷或者發生凋亡的內皮細胞，參與受損血管內皮的修復［11］。文獻表明，EPCs 存在2 種類型，分別為早期與晚期內皮祖細胞，早期EPCs 增殖能力較弱，以分泌功能為主，表達有干細胞標記分子，如CD133 等；而晚期EPCs 增殖能力較強，表達內皮標志分子VEGFR2、CD31 及vWF 等，并可受局部內環境影響，轉化為成熟的內皮細胞，維持血管發生與血管生成。近期研究表明，EPCs 尤其是晚期EPCs 可作為心血管疾病中的內皮功能的標志物，并且在臨床細胞移植治療中具有廣闊的前景［12］。

Figure 5. Effect of p53 on adhesion，migration and tube-forming ability of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on adhesion of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）；B：effect of pifithrin-α on migration ability of EPCs under LSS（scale bar=50 μm）；C：effect of pifithrin-α on tube formation of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖5 p53在LSS下對EPCs黏附、遷移和成管能力的影響

剪切應力是血流在血管內皮表面流動所產生的物理應力，在調節內皮細胞眾多重要蛋白的表達及調節血管內皮穩態中起著重要作用［13］。文獻［8］及我們的前期實驗結果表明［9，14］，剪切應力作為一種內在的物理因素，可以引起EPCs分化及功能改變，即LSS促進EPCs 向內皮分化（內皮標志分子表達增加），遷移，黏附以及血管生成能力增強，進而影響體內血管再內皮化。但也有實驗表明，EPCs 在某些異常情況下，也可以向間質細胞進行轉分化。我們前期的實驗結果表明，振蕩剪切應力（oscillating shear stress，OSS；模擬體內的擾動流）可以促進EPCs向間充質細胞轉分化，提示EPCs 在不同環境中具有雙向分化潛能。

在過去的40 年里，眾多研究證實了p53 是強大的“基因組守護者”，而近年來研究顯示，p53 還參與細胞代謝、表觀遺傳調控、細胞多能性維持、衰老調節，也有研究表明p53 的表達升高會對細胞起保護作用，故越來越多的數據顯示p53 是一個全能的“細胞守護者”，而不僅僅是“基因組守護者”［15-16］。當細胞受到刺激時，p53 通過磷酸化、乙酰化及泛素化等翻譯后修飾，從而導致一系列的反應。磷酸化是穩定p53 及增強其轉錄活性的重要因素，充當了快速打開以及關閉p53 功能的分子開關的角色［17］。部分實驗數據顯示，p53 還參與多種細胞的分化與轉分化過程［18-19］。本研究中，我們對EPCs施加12 dyn/cm2的LSS，結果顯示LSS 能夠增加p-p53 及p53 總蛋白的水平。pifithrin-α 是一種p53 的阻斷劑，也可降低核p53 的穩定性，抑制p53 依賴性的p53 應答基因的轉錄。本實驗中使用p53 阻斷劑pifithrin-α（10 μmol/L）阻斷p53 的作用后，發現與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EPCs 分化程度降低。內皮分化標記分子CD31 和vWF mRNA 表達較LSS 組明顯降低；流式細胞術檢測結果發現，雖然CD31 蛋白表達較LSS 組明顯降低，與mRNA 表達的結果一致，但vWF蛋白變化的差異無統計學顯著性。因為vWF為分泌型蛋白，我們進一步檢測了上清中vWF的變化，ELISA 檢測結果顯示，LSS+pifithrin-α 組流槽液中vWF蛋白的分泌量與LSS組相比明顯降低。

本實驗結果顯示，p53 在LSS 促內皮祖細胞分化中起著調控作用，抑制p53 功能后，LSS 引起的EPCs成血管、遷移及黏附能力下降，但其增殖能力增強，后者可能與p53 調控細胞衰老的機制相關［20］。結合我們近期研究，即擾動流剪切應力可以通過下調p53的表達促進EPCs 向間充質細胞轉分化［21］，我們推測，p53 可能在EPCs 的分化與轉分化中起到“分子開關”的作用，即p53 可以在LSS 作用下調節EPCs 的功能，促進EPCs 向內皮細胞轉化，而在OSS 作用下促進EPCs向間質細胞分化。

綜上所述，LSS 可能通過促進p53 的磷酸化，入核后發揮啟動子的作用，促進EPCs 向內皮細胞分化，進而影響EPCs 各種功能。p53 分子生物學功能多樣，本實驗中p53 分子在入核后發揮的具體作用以及機制我們仍然不明確，目前正在進行深入研究。