AT1-AA通過上調細胞自噬誘導大鼠心功能不全*

張志楠， 康曉慶， 王 瑾， 靳文文， 王雪嬌， 焦向英△

（1山西醫科大學生理學教研室，山西太原030001；2山西省心血管病醫院，山西太原030024）

心血管疾病是我國乃至全世界最常見的疾病之一，多數患者最后可轉為慢性心力衰竭而導致死亡［1-2］。心肌細胞屬于終末分化細胞，在心力衰竭的發展進程中，各種致病原因引起的心肌細胞凋亡使得有功能的細胞數目逐漸減少，引起心功能逐漸下降，直至最后無法代償而出現心力衰竭［3-4］，因此抑制心肌細胞凋亡可以有效延緩心功能不全的發生，是治療心力衰竭的重要策略［4-5］。近年來的研究表明，在各類心血管類疾?。òㄐ乃ィ┗颊哐逯芯鶛z測到血管緊張素Ⅱ1 型受體自身抗體（angiotensin Ⅱtype 1 receptor autoantibody，AT1-AA），其水平明顯高于正常人［6-7］，提示AT1-AA 可能參與心力衰竭進程，但在整體情況下，該抗體是否可以誘導心肌細胞凋亡引起心功能不全及其具體機制尚不清楚。

細胞自噬是真核細胞蛋白降解的途徑之一，通常被認為是細胞的一種正常保護機制，是維持細胞穩態所必需的［8］。在營養充足的條件下，可保護細胞免受錯誤折疊蛋白或受損細胞器的影響，從而防止某些疾病的發生（如神經退行性疾病和腫瘤）；饑餓等也可誘導自噬的發生，通過降解大分子物質和細胞器為細胞活動提供營養和能量來促進細胞存活［9］。然而，過多的和不受控制的自噬激活會導致必需分子和細胞器的耗竭，引起細胞凋亡［10-11］。這表明，自噬具有雙向功能，根據誘導的背景和程度不同，它可能會拮抗疾病的發病機制，也可能促進疾病的進展［12］。自噬與心血管疾病密切相關，在心力衰竭進程中發揮著多種作用［13-14］。已證實，血管緊張素Ⅱ（angiotension Ⅱ，Ang Ⅱ）可以誘導自噬［15-16］，AT1-AA 具有類Ang Ⅱ的激動樣作用［17］，那么AT1-AA 是否也會對心肌細胞的自噬產生影響，如果有影響，自噬在AT1-AA引起的心功能不全及心肌細胞凋亡中的作用如何，值得我們深入探討。

研究發現，AT1-AA 是一種G 蛋白偶聯受體（Gprotein-coupled receptor，GPCR）自身抗體，可以特異性結合血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AT1R），通過專一性識別AT1R 細胞外第二環（the second extracellular loop of AT1R，AT1R-ECⅡ）功能表位肽段而發揮類Ang Ⅱ激動效應［18］。因此，我們猜測AT1-AA 可能通過與AT1R 結合引起心功能不全。因此，本研究的主要目的是觀察AT1-AA是否通過AT1R，使大鼠心肌細胞自噬上調，誘導在體大鼠心肌細胞凋亡，進而引起心功能不全，參與心力衰竭的進程。

材料和方法

1 動物和材料

SD 大鼠和AT1aR基因敲除8 周齡雄性SD 大鼠，由首都醫科大學劉慧榮教授贈送（南京大學-南京生物醫藥研究院制備）。PCR 引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列見表1；AT1R-ECⅡ（序列 為165～191，IHRNVFFIENTNITVCAFHYESQN?STL）肽段購于上海吉爾生化公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購于Bio-Rad；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和HE檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1、P62、caspase-3和β-actin抗體購于CST。

表1 PCR引物序列Table 1. Primer sequences for PCR

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 PCR 基因鑒定后分組，分為空白對照（vehicle）組、AT1-AA 免疫（AT1-AA）組、AT1-AA+3-MA 組和AT1aR-/-+AT1-AA 組。前3 組為8 周齡雄性SD大鼠（AT1aR基因敲除SD大鼠子代中陰性純合子），第4 組為8 周齡雄性AT1aR基因敲除鼠，每組6 只。除空白對照組大鼠外，其余大鼠均進行首次免疫［將人同源性AT1R-ECⅡ肽段（0.4 μg/g）溶于Na2CO3稀釋溶液溶解，與完全弗氏佐劑1∶1 混勻后，多點背部皮下注射］及加強免疫（將完全佐劑換為不完全弗氏佐劑，每2 周1 次，共免疫12 周），每次加強免疫前從尾靜脈取血，留取大鼠血清；vehicle 組將抗原溶液換位等量Na2CO3溶液，其余同免疫組。AT1-AA+3-MA組，免疫8周時從AT1-AA免疫組隨機分出6只腹腔注射3-MA（10 mg/kg），隔天1次，共4周。

2.2 SA-ELISA 法檢測血清抗體水平 用人工生物合成的AT1R-ECⅡ抗原肽段包被抗原于96 孔板，4℃過夜。加入封閉液，37℃水浴箱中封閉1 h，PBST 溶液清洗。37℃水浴1.5 h 孵育I 抗，PBST 溶液清洗，靜置風干。37℃水浴孵育Ⅱ抗羊抗大鼠IgG 1 h，PBST 溶液清洗。加鏈酶卵白素37℃水浴箱1 h，PBST 溶液清洗。加入底物ABTS 緩沖液水浴箱中30 min 顯色。用酶標儀檢測吸光度（A）值，得到血清抗體濃度。

2.3 小動物超聲儀檢測心臟結構和功能的變化異氟烷輕度麻醉大鼠，左側前胸脫毛。GE Vivid 7 Dimension Ultrasound 超聲儀進行超聲心動圖檢查，取短軸切面。測定左心室舒張末期內徑（left ven?tricular end-diastolic inner dimension，LVIDd）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic inner diameter，LVIDs）、左心室舒張末期后壁厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LPWDd）、左心室收縮末期后壁厚度（left ventricular end-systolic posterior wall thickness，LPWDs）、左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）和左心室收縮末期容積（left ventricular endsystolic volume，LVESV）作為反映心臟結構的指標。測定左心室射血分數（left ventricular ejection frac?tion，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）作為反映心臟功能的指標。連續測量3次，取平均值。

2.4 HE 染色 采用4%多聚甲醛固定和石蠟包埋的大鼠心臟。取左室橫切面3 μm 連續切片，常規蘇木精-伊紅（HE）染色。Olympus BX51 正置顯微鏡獲取圖像。

2.5 TUNEL 染色檢測心臟組織細胞凋亡情況 將石蠟包埋的心臟組織左室橫切面2 μm 連續切片，根據TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測。Olympus BX51正置顯微鏡獲取圖像。心肌細胞凋亡指數（apoptotic index，AI）=凋亡心肌細胞核數/心肌細胞核總數×100%。

2.6 Western blot 檢測自噬和凋亡相關蛋白水平分別檢測自噬起始的重要調節因子beclin-1、自噬體形成的標志蛋白LC3 及自噬底物P62 的表達和凋亡相關蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平。取0.05 g 心臟組織，加500 μL 裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑PMSF，眼科剪剪碎后超聲碎裂，冰上裂解2.5 h，12 000 r/min、4℃離心15 min，取上清。BCA 法測蛋白濃度，SDS-PAGE 分離，轉膜，封閉，I 抗和Ⅱ抗孵育，滴加ECL 發光液曝光。ImageJ 軟件分析曝光條帶灰度值。以β-actin作為蛋白表達的內參照。

3 統計學處理

用SPSS 16.0 和GraphPad Prism 6.02 軟件進行統計分析。數據均以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較使用獨立樣本t檢驗；多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較使用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AT1-AA陽性大鼠模型的建立

SA-ELISA 方法檢測大鼠血清中的AT1-AA 水平。結果顯示，與vehicle 組相比，AT1-AA 免疫組免疫第2 周時血清AT1-AA 含量升高（P＜0.05），隨著免疫時間延長，血清中AT1-AA 抗體滴度逐漸升高，免疫8 周時AT1-AA 抗體滴度達到峰值并到實驗結束一直維持在高水平（P＜0.01），提示AT1-AA 陽性大鼠造模成功，見圖1A。

PCR 鑒定不同基因型大鼠DNA 的水平。圖1B結果顯示，1和2為SD 大鼠（AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中陰性純合子），3 和4 為AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中陽性雜合子，5 為AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中陽性純合子。

2 AT1-AA 長期存在可以引起大鼠心肌損傷、心功能下降及心臟結構的改變

心臟超聲結果圖見圖2A，與vehicle 組相比，AT1-AA 免疫組大鼠在免疫12 周時的LVIDs 和LVESV 均顯著增加（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均明顯下降（P＜0.05），見圖2。

HE 染色結果顯示，vehicle 組心肌細胞排列整齊，細胞致密，細胞核大小均一，橫紋清晰，細胞間隙正常，心肌纖維未見明顯斷裂。與vehicle 對照組相比，AT1-AA 免疫組大鼠在免疫12 周時心肌細胞排列紊亂，細胞核大小明顯不同，細胞質空泡化，橫紋模糊，細胞間隙扭曲增寬，心肌纖維走向紊亂且破裂，見圖2J。

以上結果提示AT1-AA 長期存在可以引起大鼠心肌損傷、心功能下降及心臟結構改變。

3 AT1-AA長期存在可以引起心肌細胞凋亡增加

TUNEL 染色結果顯示，與vehicle 組相比，在免疫12 周時免疫組大鼠心臟組織中TUNEL 染色陽性即棕黃色細胞核增多，心肌細胞凋亡指數增加（P＜0.05），見圖3A。

Western blot 檢測凋亡相關蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平，結果顯示：與vehicle 組相比，AT1-AA 免疫組在免疫12 周時心臟組織的cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平增加（P＜0.05），說明凋亡水平上升，見圖3C。以上結果提示AT1-AA 長期存在可以誘導心臟組織凋亡增加。

Figure 1. AT1-AA positive rats were successfully established. A：characteristics of AT1-AA in serum. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs vehicle group. B：PCR results for AT1aR knockout rats. M：marker；P：positive control；1，2：AT1aR-/- mice；3，4：AT1aR-/+mice；5：AT1aR+/+mice.圖1 AT1-AA陽性大鼠造模成功的鑒定結果

4 AT1-AA 長期存在可以引起心臟組織自噬水平升高

Western blot 檢測自噬相關蛋白LC3、beclin-1 和P62 的蛋白表達。結果顯示與vehicle 組相比，AT1-AA 免疫組在免疫12周時心臟組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1 蛋白的水平增加（P＜0.05），而P62 蛋白的水平降低（P＜0.05），見圖4。提示AT1-AA 可以誘導心臟組織細胞自噬水平升高。

5 自噬抑制劑3-MA可以抑制AT1-AA誘導的大鼠心臟組織細胞自噬和凋亡水平，改善心功能不全

腹腔注射3-MA 4 周后，取大鼠心臟組織用Western blot 檢測自噬相關蛋白的表達水平。結果顯示與AT1-AA免疫組相比，AT1-AA+3-MA組心臟組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1 蛋白的水平降低（P＜0.05），而P62 蛋白的水平升高（P＜0.05），見圖4，提示自噬抑制劑3-MA可以抑制AT1-AA誘導的大鼠心臟組織細胞自噬水平。

腹腔注射3-MA 4 周后，TUNEL 染色檢測心臟組織細胞凋亡情況，Western blot 檢測凋亡相關蛋白的表達水平。TUNEL 染色結果顯示，與AT1-AA 免疫組相比，AT1-AA+3-MA 組大鼠心臟組織棕黃色顆粒較少，心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖3A；Western blot 結果顯示與AT1-AA 組相比，AT1-AA+3-MA 組心臟組織的cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平下降（P＜0.05），說明凋亡減少，見圖3B。以上結果提示抑制自噬可減少AT1-AA 誘導的心臟組織細胞凋亡。

小動物超聲儀檢測心臟功能和結構變化，HE 染色觀察心臟結構變化。超聲檢測結果顯示，與AT1-AA 免疫 組相 比，AT1-AA+3-MA 組大鼠 的LVIDs 和LVESV 均下降（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均顯著增加（P＜0.05），見圖2。HE 染色結果顯示，與AT1-AA 免疫組相比，AT1-AA+3-MA 組心肌細胞排列紊亂減少，細胞質空泡化減少，橫紋較清晰，細胞間隙扭曲增寬程度降低，心肌纖維走向紊亂且破裂程度較輕，心肌細胞溶解減少，見圖2J。以上結果提示自噬抑制劑3-MA 可以減輕AT1-AA 誘導的大鼠心肌損傷、心臟結構改變及心功能不全。

6 AT1aR 敲除可以使AT1-AA 誘導的心臟組織自噬和凋亡水平降低，心功能不全改善

AT1aR敲除鼠主動免疫12 周時，Western blot 檢測大鼠心臟組織自噬相關蛋白的表達水平。結果顯示與AT1-AA 免疫組相比，AT1aR-/-+AT1-AA 組心臟組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1 蛋白的水平降低（P＜0.05），而P62 蛋白的水平則升高（P＜0.05），見圖4，提示敲除AT1aR可以使AT1-AA 誘導的大鼠心臟組織細胞自噬水平降低。

Figure 2. AT1-AA positive rats had decreased cardiac function and damaged heart structure，and both autophagy inhibitor 3-MA and AT1a receptor knockout reduced the functional and structural damages of heart and attenuated cardiac insufficiency in the rats. A：the images of representative of echocardiography；B：left ventricular end-systolic inner diameter（LVIDs）；C：left ventricular end-systolic volume（LVESV）；D：left ventricular ejection fraction（LVEF）；E：left ventricular fraction shortening（LVFS）；F：left ventricular end-diastolic inner diameter（LVIDd）；G：left ventricular end-diastolic volame（LVEDV）；H：left ventricular end-systolic wall thickness（LPWDs）；I：left ventricular end-diastolic wall thickness（LPWDd）；J：the results of HE staining（scale bar=200 μm）. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.圖2 AT1-AA陽性大鼠心臟功能下降和結構損傷，自噬抑制劑3-MA和AT1aR敲除都可以減輕大鼠心臟功能和結構損傷，改善心功能不全

AT1aR敲除鼠主動免疫12 周時，TUNEL 染色和Western blot 檢測心臟組織細胞凋亡情況。TUNEL染色結果顯示，與AT1-AA 免疫組相比，AT1aR-/-+AT1-AA 組大鼠心臟組織棕黃色顆粒較少，心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖3A。Western blot 結果顯示與AT1-AA 組相比，AT1aR-/-+AT1-AA 組心臟組織凋亡相關蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平下降（P＜0.05），見圖3B，說明凋亡水平下降，提示敲除AT1aR可減輕AT1-AA 誘導的心臟組織細胞凋亡水平。

Figure 3. The apoptosis of AT1-AA positive rat heart tissue was increased，and both autophagy inhibitor 3-MA and AT1aR knockout reduced the apoptosis induced by AT1-AA in heart tissue. A：results of TUNEL staining（the scale bar=200 μm）；B：the protein levels of caspase-3 protein in different rat heart tissues determined by Western blot. Mean±SEM. n=6. * P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.圖3 AT1-AA陽性大鼠心臟組織細胞凋亡增加，自噬抑制劑3-MA和AT1aR敲除均可降低AT1-AA誘導的心臟組織細胞凋亡

AT1aR敲除鼠主動免疫12 周時，小動物超聲檢測心臟功能和結構變化，HE 染色觀察心臟結構變化。超聲檢測結果顯示，與AT1-AA 免疫組相比，AT1aR-/-+AT1-AA 組大鼠的LVIDs 和LVESV 均下降（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均顯著增加（P＜0.05），見圖2。HE 染色結果顯示，與AT1-AA 免疫組相比，AT1aR-/-+AT1-AA 組大鼠的心肌細胞排列紊亂減輕，橫紋較清晰，細胞間隙扭曲增寬程度降低，心肌纖維走向紊亂且破裂程度較輕，見圖2J。以上結果提示AT1aR敲除可以使AT1-AA 誘導的大鼠心肌損傷和心臟結構改變程度減輕，改善心功能不全。

討 論

近年來，心血管疾病已成為威脅人類健康的重大疾病［1-2］。許多心血管疾病的最終結果是心力衰竭，這是一種心臟無法滿足身體代謝需求的綜合征，已經成為心血管疾病的主要死亡原因［1-2］。臨床心衰患者血清中可檢測出高滴度的AT1-AA［6-7］。本研究通過使用小動物超聲儀檢測大鼠心臟功能變化，小動物超聲和HE 染色檢測大鼠心臟結構的變化。左心室射血分數、短軸縮短率、左心室收縮末期內徑及左心室收縮末期容積等指標是評價左心室整體功能的重要指標，即診斷心衰的重要指標［2］。實驗結果顯示AT1-AA 的長期存在可以使心功能下降及心臟結構改變。

心肌細胞損傷和死亡在心功能不全的發展過程中發揮重要作用。細胞凋亡作為細胞程序性死亡的方式之一，心肌細胞凋亡的持續存在可以增加心肌細胞死亡，導致心功能不全，抑制心肌細胞死亡可有效改善心功能［4-5］。我們實驗室的前期研究發現在培養心肌細胞中給予AT1-AA 處理能夠誘導心肌細胞凋亡［19］，本實驗使用TUNEL 染色和Western blot 技術發現AT1-AA 長期存在可以引起心臟組織細胞凋亡增加，提示AT1-AA 可能參與心力衰竭進程，但在心功能不全中AT1-AA 誘導心肌細胞凋亡的具體機制尚不清楚。

Figure 4. The expression of autophagy-related proteins was changed in the heart tissues of AT1-AA positive rats，and both autophagy inhibi?tor 3-MA and AT1aR knockout changed the expression of autophagy-related proteins in heart tissues induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6. *P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.圖4 AT1-AA 陽性大鼠心臟組織自噬相關蛋白表達變化，自噬抑制劑3-MA 和AT1aR 敲除均可改變AT1-AA 誘導的心臟組織自噬相關蛋白的水平

自噬是溶酶體降解并清除受損細胞器的過程。通過平衡細胞合成和分解，自噬可以穩定細胞內環境［8］。然而，過多的和不受控制的自噬可致細胞的程序性死亡［10-11］。自噬的程度可用LC3-Ⅱ/LC3-I 比值評價，隨著自噬增加，LC3-Ⅱ表達逐漸增多［10］。P62受體是自噬的底物結合物，在自噬溶酶體降解過程中，P62 受體被降解清除，而當自噬受阻，P62 蛋白的表達則顯著增加［3］。Beclin1 作為哺乳動物同系物，有促進自噬活性的作用［10］。本研究通過用Western blot 法檢測自噬相關蛋白，發現AT1-AA 可以激活自噬；為了進一步探討自噬對AT1-AA誘導心臟組織細胞凋亡的影響，我們給大鼠腹腔注射自噬抑制劑3-MA，發現自噬參與AT1-AA 誘導心功能不全中心肌細胞凋亡的過程。

研究表明，AT1-AA 可以通過專一識別、結合AT1R 來發揮類血管緊張素Ⅱ的激動樣作用［18］。因此為了進一步探討AT1aR 在AT1-AA 陽性大鼠心功能不全進程中的作用及意義，我們使用AT1aR敲除大鼠，主動免疫構建AT1-AA 陽性大鼠模型，觀察AT1aR敲除對AT1-AA 陽性大鼠心肌細胞損傷、心臟結構改變及心功能的影響，同時檢測心肌細胞凋亡和自噬水平的變化。結果提示敲除AT1aR可以抑制AT1-AA 誘導的大鼠心臟組織自噬和凋亡水平，減弱AT1-AA 誘導的大鼠心肌損傷、心臟結構改變，改善心功能不全。本結果證明AT1-AA 確是作為受體激動劑，需要與AT1R 結合，才能發揮其誘導自噬和凋亡，導致大鼠心肌損傷的作用。

綜上所述，AT1-AA 可以作用于AT1aR，上調大鼠心臟組織自噬，誘導在體大鼠心肌細胞凋亡，進而引起心功能不全，參與心力衰竭的進程。本研究結果可為臨床治療心力衰竭特別是AT1-AA 陽性心力衰竭提供理論依據和治療的潛在靶點。