菟絲子黃酮通過調控ZBED3-AS1影響成骨細胞凋亡*

孫奇華， 蔡紅慧， 何愛玉， 祝炳軍

（紹興文理學院附屬醫院中西醫結合科，浙江紹興312000）

骨質疏松是一種常見的代謝性骨病變，表現為骨量減少，骨微結構破壞、骨脆性和骨折風險增加［1］。成骨細胞是骨重建中的關鍵細胞，其活力減弱和功能降低可導致骨形成和骨吸收之間失衡，最終導致骨質疏松發生［2］。因此，如何有效的提高成骨細胞活力，對于防治骨質疏松癥具有重要意義。菟絲子別名黃絲、黃藤子和豆寄生，是雙子葉植物旋花科植物菟絲子的干燥種子，《中國藥典》等典籍對其藥理作用均有記載。菟絲子黃酮（total flavones from Cuscuta chinensis，TFCC）是菟絲子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、補腎益精、養肝明目和免疫增強作用［3-5］。此外，TFCC可能通過抑制成骨細胞凋亡對大鼠激素型骨質疏松癥具較好的骨保護作用［6］，但其具體的分子機制尚不明確。含BED 型鋅指蛋白3 反義RNA 1（zinc finger BED-type containing protein 3 antisense RNA 1，ZBED3-AS1）是近年來發現的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），可誘導間充質干細胞的成骨分化，提高骨再生能力［7］。然而TFCC 能否通過調控ZBED3-AS1 表達進而影響成骨細胞凋亡尚未可知。因此，本研究通過觀察TFCC 對腫瘤壞死因子α（tu?mor necrosis factor-α，TNF-α）處理的成骨細胞增殖、凋亡及ZBED3-AS1表達的影響，揭示其分子機制，以期為TFCC用于防治骨質疏松提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗材料和主要試劑

成骨樣細胞株UMR-106購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。DMEM 培養液、胎牛血清和青-鏈霉素溶液購于Gibco；TNF-α 購于Sigma；TFCC 粉購于上海源葉生物科技有限公司；ZBED3-AS1 過表達載體（pcDNA3.1-ZBED3-AS1）及其對照（pcDNA3.1）、ZBED3-AS1 小干擾RNA（si-ZBED3-AS1）及其對照（si-NC）和PCR 引物由上海吉瑪制藥有限公司提供；CCK-8 購于日本同仁公司；annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液和Trizol 試劑盒購于上海碧云天生物科技公司；兔源caspase-3 抗體、兔源p21抗體和山羊抗兔IgG購于CST。

2 方法

2.1 細胞培養和轉染 UMR-106 細胞采用DMEM培養液（添加10%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素溶液）進行培養，按照1∶3 比例傳代，每周換液2～3 次。將對數期UMR-106 細胞按照每孔2×105接種到6 孔板，當細胞融合度達到50%時，更換不含血清培養基。首先取50 pmol 的載體與適量無血清培養基混勻，使終體積為25 μL，記為混合物A。取1 μL 的Li?pofectamineTM2000 與24 μL 無血清培養基混勻，記為混合物B。靜置5 min 后，將A 與B 混合，記為混合物C。室溫靜置15 min，將混合物C 加入到融合度約為50%的UMR-106 細胞中，6 h 后更換含血清培養基，轉染48 h后，收集細胞用于后續實驗。

2.2 細胞分組和處理 UMR-106 細胞按照每孔2.5×104個接種于24 孔板，未轉染的細胞分為對照（control）組（正常培養）、TNF-α 組（30 μg/L TNF-α 處理24 h［8］）、TNF-α+TFCC-1 組、TNF-α+TFCC-2 組、TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組 和TNF-α+TFCC-5 組，后5 組分別用含0.01、0.1、1、10 和100 μg/L TFCC+30 μg/L TNF-α 的 培 養 基培養。轉染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1 的細胞用含30 μg/L TNF-α 的培養基培養，記為TNF-α+pcDNA3.1組和TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1組。轉染si-NC、si-ZBED3-AS1、pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1的細胞用含100 μg/L TFCC 和30 μg/L TNF-α 的培養液共同培養。培養24 h后，收集細胞用于后續檢測。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將UMR-106 細胞按照每孔5×103（100 μL）接種于96 孔板，按照實驗分組進行細胞處理后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，反應2 h；同時設置空白孔，用酶標儀測量450 nm 波長處各孔細胞吸光度（A），計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=（實驗組A 值-空白孔A 值）/（對照組A值-空白孔A值）×100%

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集上述各組細胞，采用結合緩沖液調整為密度1×109/L 的細胞懸液。按照annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟，用流式細胞術測定各組細胞凋亡情況。

2.5 集落形成實驗檢測集落形成能力 用胰酶消化并收集各組UMR-106 細胞，按照每板100 個，每皿5 mL 接種于直徑為60 mm 的平板，輕輕晃動使細胞分散均勻，培養至出現肉眼可見的細胞集落時，棄培養液，洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下計數大于50個細胞的集落形成數。

2.6 Western blot 檢 測p21 和caspase-3 蛋 白 的 表達 細胞按照上述分組進行處理后，加入RIPA 裂解液裂解細胞，獲得細胞蛋白，進行濃度測定。取30 μg 蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE，轉膜后，5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h，洗膜后將膜置于稀釋的I 抗溶液中室溫條件孵育2 h，洗膜后用稀釋的II 抗溶液在室溫條件孵育膜孵育1 h，加入化學發光顯色試劑進行顯影。目標蛋白的表達水平采用目標蛋白與內參照GAPDH蛋白灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 檢測ZBED3-AS1 的表達 按照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定RNA 純度，隨后利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，采 用SYBR Green 試 劑 盒 以2-ΔΔCt法 檢 測ZBED3-AS1的表達水平。ZBED3-AS1的上游引物序列為5'-TACAACTTTGCATTAACCTTCC-3'，下游引物序列為5'-TGCCCTGTCCTCATGTTCG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'，下游引物序列為5'-GCGCCCAATACGAC?CAAATC-3'。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0 進行統計學分析，實驗重復3次，數據用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞增殖的影響

與control 組比較，TNF-α 組UMR-106 細胞活力和集落形成能力顯著降低，p21 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細胞活力、集落形成能力和p21 蛋白表達無顯著變化；與TNF-α組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TFCC-5 組細胞活力和集落形成能力顯著升高，p21 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2 TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞凋亡的影響

與control 組比較，TNF-α 組UMR-106 細胞凋亡率和caspase-3 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與TNFα 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細胞凋亡率及caspase-3 蛋白表達無顯著變化；與TNFα 組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TFCC-5 組細胞凋亡率和caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞ZBED3-AS1表達的影響

與control 組比 較，TNF-α 組UMR-106 細 胞中ZBED3-AS1 表達顯著降低（P＜0.05）；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細胞中ZBED3-AS1 表達無顯著變化；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TF?CC-5 組細胞中ZBED3-AS1 表達顯著升高（P＜0.05），見圖3。

4 過表達ZBED3-AS1 對TNF-α 作用下UMR-106細胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+pcDNA3.1組比較，TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 組UMR-106 細胞活力和集落形成能力顯著升高，凋亡率顯著降低，p21 和caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖4。

5 抑制ZBED3-AS1 能減輕TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106細胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+TFCC-5+si-NC組比較，TNF-α+TFCC-5+si-ZBED3-AS1 組UMR-106 細 胞 中ZBED3-AS1 表達顯著降低，細胞活力和集落形成能力顯著降低，凋亡率顯著升高，p21 和caspase-3 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖5。

6 過表達ZBED3-AS1 能增強TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106細胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1 組比較，TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 組UMR-106 細 胞 中ZBED3-AS1 表達顯著升高，細胞活力和集落形成能力顯著升高，凋亡率顯著降低，p21 和caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖6。

討 論

長期以來，菟絲子被認為具有骨質疏松保護作用。趙素霞等［9］通過切除雙側大鼠卵巢法制備骨質疏松模型發現，TFCC 可增加去卵巢大鼠骨密度，改善骨質疏松癥狀。此外，多項體外細胞實驗表明10%菟絲子含藥血清和TFCC 均能夠促進大鼠成骨細胞的增殖與分化，具有成骨促進作用［10-11］。TNF-α是骨質疏松組織中高表達的細胞因子之一，其可誘導成骨細胞凋亡，其誘導的成骨細胞是研究骨質疏松的常用體外細胞模型［8，12-13］。本研究發現，TNF-α誘導后UMR-106 細胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高，而一定濃度的TFCC 干預后TNF-α 誘導的UMR-106 細胞凋亡率降低，活力和集落形成能力升高，提示TFCC 可提高成骨細胞的增殖能力，降低成骨細胞凋亡率。p21是細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-de?pendent kinases，CDKs）抑制劑家族中的重要成員，它通過抑制CDKs 復合物活性，阻滯細胞周期進程，從而發揮抗增殖作用，抑制p21 可推動成骨細胞周期完成，對骨質疏松癥具有潛在治療作用［14-15］。cas?pase-3是細胞凋亡的必經之路，其激活可引起細胞不可逆轉的凋亡［16-17］。本研究發現，TNF-α 誘導后UMR-106 細胞中p21 和caspase-3 表達增加，而TFCC干預可顯著降低p21 和caspase-3 的水平，與功能分析結果一致。以上研究提示，TFCC可減輕TNF-α誘導的成骨細胞凋亡。

Figure 1. Effects of TFCC on the viability（A），colony-forming ability（B，C）and p21 protein expression（D）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖1 TFCC對TNF-α作用下UMR-106細胞活力、集落形成能力及p21蛋白表達的影響

Figure 2. Effects of TFCC on apoptosis（A）and caspase-3 protein expression（B）in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD.n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖2 TFCC對TNF-α作用下UMR-106細胞凋亡及caspase-3蛋白表達的影響

Figure 3. Effect of TFCC on the expression of ZBED3-AS1 in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖3 TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞中ZBED3-AS1表達的影響

Figure 4. Effects of over-expression of ZBED3-AS1（A）on the viability（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+pcDNA3.1 group.圖4 過表達ZBED3-AS1對TNF-α作用下UMR-106細胞活力、集落形成能力、凋亡及p21和caspase-3蛋白表達的影響

ZBED3-AS1 的基因位于5q13.3，研究顯示ZBED3-AS1 在誘導軟骨分化過程中上調，可促進人滑液間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的軟骨分化，對骨關節炎的治療具有重要意義［18-19］。此外，ZBED3-AS1通過靶向IL-1β可增加礦化結節數量，提高堿性磷酸酶活性，促進間充質干細胞增殖和成骨分化，提高骨再生能力［7］。本研究發現，一定濃度的TFCC 干預可升高TNF-α 誘導后UMR-106 細胞中ZBED3-AS1 的表達水平，提示TFCC 可能通過上調ZBED3-AS1表達來減輕TNF-α誘導后UMR-106細胞凋亡。進一步研究顯示，過表達ZBED3-AS1 可提高TNF-α 誘導下UMR-106 細胞活力和集落形成能力，減輕TNF-α 誘導的UMR-106 細胞凋亡，并降低增殖抑制蛋白p21 和凋亡促進蛋白caspase-3 的表達水平，增強TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞活力、集落形成和凋亡的影響。抑制ZBED3-AS1表達則減輕TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞活力、集落形成和凋亡的影響。以上研究說明，上調ZBED3-AS1 表達是TFCC 對TNF-α 誘導的成骨細胞發揮保護作用的重要機制。

Figure 5. Inhibition of ZBED3-AS1（A）reduced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNFα+TFCC（100 μg/L）+si-NC group.圖5 抑制ZBED3-AS1 能減輕TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表達的影響

Figure 6. Over-expression of ZBED3-AS1（A）enhanced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apopto?sis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+TFCC（100 μg/L）+pcDNA3.1 group.圖6 過表達ZBED3-AS1 能增強TFCC 對TNF-α 作用下UMR-106 細胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表達的影響

綜上所述，本研究證實TFCC 通過上調ZBED3-AS1 表達能夠抑制TNF-α 引起的成骨細胞凋亡，促進細胞增殖，提示TFCC 在骨質疏松抗成骨細胞凋亡治療方面具有潛在應用價值。