IFN-γ通過激活JAK/STAT信號通路上調手足口病患兒OAS1表達*

吳柳松， 何 英， 徐洪波， 陳 艷

（遵義醫科大學附屬醫院小兒內二科，貴州遵義563000）

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種由屬于小RNA 病毒科的多種腸道病毒引起的兒童常見急性傳染病［1］，好發于學齡前兒童。部分患兒可出現腦炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎以及循環衰竭等嚴重并發癥，嚴重危害嬰幼兒身體健康，甚至可能導致死亡。雖然手足口病的易感因素、發病機制及免疫特點等至今尚未完全明確，但宿主基因與病毒易感性的關系越來越受重視［2］。已經證實，宿主基因遺傳背景在HFMD 的發生、發展過程中起著重要作用，宿主的遺傳因素可通過調控某些細胞因子的表達或對細胞因子的反應性而調控宿主的免疫狀態［3］。

干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）是一種由特異性抗原刺激T 淋巴細胞產生的多功能細胞因子，具有抗病毒、調節免疫系統等重要作用［4］。研究證實，IFN-γ 的異常表達與HFMD 的發生發展密切相關，是HFMD 病情嚴重程度及病情進展過程中的重要細胞因子，在HFMD 發病早期就出現表達升高，并可提示疾病重癥發展的趨勢［5］。2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶1（2'，5'-oligoadenylate synthetase 1，OAS1）是一種由干擾素誘導的抗病毒蛋白，具有激活潛在性RNA 酶活性、降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促進病毒感染細胞發生凋亡的作用［6］。OAS1也是細胞信號通路中對細胞和環境脅迫產生響應的重要激酶，參與機體非特異性免疫和特異性免疫，在機體的抗病毒、信號轉導等過程中起重要作用［3，7］。有研究報道，OAS1 作為干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）成員之一，其SNP 類型以及表達異常與HFMD 的易感性和臨床表型相關［8］。然而，在HFMD中，IFN-γ 是否可以介導OAS1 基因的表達上調，依賴何種途徑？目前尚不清楚。本研究主要探討IFNγ 介導OAS1 基因表達升高的分子機制，并從遺傳學角度為兒童HFMD 病情進展的早期診治及發病機制提供理論依據。

材料和方法

1 研究對象

本研究選取于2015 年10 月～2019 年12 月在遵義醫科大學附屬醫院兒科住院治療的140 例HFMD患者，其中男童95 例，女童45 例，中位年齡2 歲5 個月，診斷均符合我國衛建委制定的《手足口病診療指南（2018 版）》標準。另外以同期在我院體檢的健康兒童60 例作為健康對照組，其中男童34 例，女童26例，中位年齡2 歲1 個月；所有病例組及對照組兒童入組實驗均經過家屬同意，并簽署知情同意書，所有檢測對象均于住院或就診當日清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，上述研究得到遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會批準同意。

2 病例分組

根據不同臨床表現以及病情輕重，分為普通或輕癥手足口病（mild HFMD，mHFMD）以及重癥手足口病（severe HFMD，sHFMD），其中mHFMD 組82例，sHFMD 組58 例。mHFMD 為急性起病，伴或不伴發熱，口腔粘膜出現散在皰疹，手、足和臀部出現斑丘疹、皰疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀。sHFMD 表現為中樞神經系統或者心肺功能損傷，在發病1～5 d 左右出現腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環障礙等，體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失，MRI顯示有腦部病變。

3 試劑與儀器

RPMI-1640 培養基和胎牛血清（Gibco）；IFN-γ和AG490（Sigma）；兔抗OAS1、Janus 激酶（Janus ki?nase，JAK）1、JAK2、信號轉導和轉錄激活因子（sig?nal transducer and activator of transcription，STAT）1、p-JAK1、JAK2 和p-STAT1 單克隆抗體（Abcam）；兔抗β-actin 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物技術公司；Trizol（Invitrogen）；PCR 引物（上海生工生物工程公司）；RT-qPCR 試劑盒（TaKaRa）。超微量分光光度計（Implen）；高速離心機和Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機（Eppendorf）；ChemiDoc 型凝膠成像系統（Bio-Rad）；超凈工作臺（北京亞泰科隆科技公司）；賽默飛3111 型CO2培養箱和Varioskan Lux 全波長酶標儀（Thermo Scientific）。

4 方法

4.1 外周血單個核細胞（peripheral blood mononu?clear cells，PBMCs）的提取和培養 取HFMD 患兒肝素抗凝外周血2 mL，用等體積生理鹽水稀釋混勻后，緩慢沿試管壁加入到含有等總體積的Ficoll 液面之上；室溫下2 000 r/min 離心30 min，可見試管內的液體清晰地分為4 層，單個核細胞為處于第1 層和第2層中間的白色細胞；用吸管將單個核細胞層吸出收集到另1 試管中，用生理鹽水洗滌2 遍，室溫下1 500 r/min 離心10 min，棄上清后即得到較高純度的單個核細胞懸液。

4.2 細胞培養及實驗分組 將PBMCs 加入到含10%胎牛血清的RPMI-l640 培養基中，置于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養至對數生長期備用。使用前將常規培養的PBMCs細胞無血清同步化培養24 h后隨機分成3 組：對照（control）組、IFN-γ 干預組（用5×105U/L IFN-γ 干預細胞）和IFN-γ+AG490 干預組（用200 mmol/L AG490預處理45 min后加入5×105U/L IFN-γ 干預細胞），分別于加IFN-γ 前（0 h）和加IFN-γ后2、4、8、12和24 h收集細胞。

4.3 RT-qPCR 檢測OAS1 的mRNA 表達 取新鮮肝素抗凝外周血4 ml，室溫下2000 r/min 離心10 min，棄上清。取250 μL 血細胞按1∶4 體積加入RNAiso Plus，冰上裂解10 min，按說明書要求分別加入氯仿、異丙醇、無水乙醇以及離心處理，待提出總RNA 后，用適量的DEPC 水稀釋，在ND-1000分光光度計上檢測RNA 的濃度和純度。按Trizol 法提取PBMCs 總RNA，經紫外分光光度計定量。嚴格按RT-qPCR 試劑盒操作進行逆轉錄，逆轉錄反應條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃hold。逆轉錄完成后的cDNA 加入到RT-qPCR 反應體系中。OAS1 的上游引物序列為5'-GTCAGTTGACTGGCGGCTAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTGCTTCAGGAAGTCTCT-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下游引物序列為5'-AGCGTCAAAGGTGGAG?GAGTG-3'。RT-qPCR 條件為：95℃3 min；95℃5 s，59.5℃30 s，共30 個循環。以GAPDH 作為內參照，目的基因OAS1的表達根據儀器檢測的Ct值，通過公式2-ΔΔCt進行相對定量分析計算得到。

4.4 Western blot 檢測OAS1、JAK1、JAK2、p-JAK1、JAK2、STAT1和p-STAT1的蛋白水平 如4.3所述將外周血離心、棄上清后，取500 μL 血細胞，按1∶2 體積加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，收集充分裂解的細胞及所有殘液，4℃、12000 r/min 離心30 min，取上清，用BCA 法進行蛋白定量。收集不同時點的PBMCs，按說明書要求冰上提取細胞總蛋白和核蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取蛋白40～80 μg，進行SDS-PAGE 分離和轉膜操作，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，磷酸化抗體用5% BSA 溶液封閉2 h，按對應抗體推薦濃度加入I 抗4℃孵育過夜，經TBST洗膜后加入對應HPR 標記的IgG，孵育后洗膜，ECL化學發光檢測目的條帶，在凝膠成像系統上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內參照蛋白的灰度值之比計算相應蛋白表達量。

5 統計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。實驗計量數據按均數±標準差（mean±SD）表示，資料經正態性及方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 和Dunnett 法。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 OAS1在HFMD患兒外周血中的表達

分別用RT-qPCR 以及Western blot 檢測HFMD患兒外周血OAS1 的表達，結果顯示，與正常對照組比較，mHFMD 組和sHFMD 組OAS1 的mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），sHFMD 組OAS1 的mRNA 表達顯著高于mHFMD 組（P＜0.01），即隨著HFMD 病情加重，OAS1的mRNA 表達進一步升高；Western blot 的結果與RT-qPCR結果一致，見圖1。

2 IFN-γ 能夠上調HFMD 患兒PBMCs 中OAS1 的表達

在HFMD 患兒PBMCs中加入5×105U/L IFN-γ和200 mmol/L AG490 進行干預，分別于0、2、4、8、12 和24 h 不同時點收集細胞，Western blot 檢測PBMCs 細胞中OAS1蛋白的表達。結果顯示，與正常對照組相比，IFN-γ干預組PBMCs中各觀察時點OAS1的蛋白水平隨著刺激時間的延長逐漸升高，并呈時間依賴性（P＜0.05），而AG490+IFN-γ 組PBMCs 中OAS1 蛋白的表達較IFN-γ 組呈時間依賴性顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 IFN-γ 能 夠 促 進PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1磷酸化

在HFMD 患兒PBMCs 中加入IFN-γ 以及AG490進行干預，分別于0、2、4、8、12 和24 h 不同時點收集細 胞，Western blot 檢 測PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1 蛋白及磷酸化的水平。結果發現，IFN-γ 刺激組的細胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各時點p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1的蛋白水平較正常對照組均顯著升高（P＜0.05），并隨著刺激時間的延長逐漸升高，呈時間依賴性；在各時點之間，JAK1、JAK2和STAT1蛋白水平的差異無統計學顯著性（P?0.05）；AG490+IFNγ 組 的p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 蛋 白 水 平 較 較IFN-γ組均顯著降低，并隨著干預時間的延長呈時間依賴性降低（P?0.05），見圖3。

4 IFN-γ促進PBMCs中STAT1蛋白核轉位

Figure 1. The expression of OAS1 at mRNA（A）and protein（B）levels in the peripheral blood of children with HFMD. Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs mHFMD group.圖1 OAS1在HFMD患兒外周血中的表達

提取細胞的核蛋白，以histone H3 為內參照，采用Western blot 檢測PBMCs 中STAT1 核蛋白水平，結果顯示，IFN-γ 刺激組的細胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各時點STAT1 核蛋白水平較正常對照組均顯著升高（P?0.05），并隨著刺激時間的延長逐漸升高，呈時間依賴性；AG490+IFN-γ 組STAT1 核蛋白的表達較IFN-γ組則呈時間依賴性顯著降低，核轉位顯著減少（P?0.05），見圖4。

討 論

Figure 2. The expression of OAS1 protein in the PBMCs of chil?dren with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖2 HFMD患兒PBMCs細胞中OAS1蛋白的表達

HFMD 是一種由多種腸道病毒引起的兒童常見傳染病，若不及早有效準確進行診治和干預極易進展為重癥，嚴重危害患兒身體健康。目前，HFMD 的發病機制尚未完全明確，越來越多的研究證實，機體免疫細胞功能紊亂和細胞因子的表達異常在HFMD的發生發展中起關鍵和核心作用［9］。INF-γ 作為一種多功能細胞因子，是抗病毒感染、抗腫瘤免疫反應等多個生理病理過程中的關鍵調控因子。本課題組前期研究發現，INF-γ 在HFMD 的發病過程中起重要作用，并可作為HFMD 病情嚴重程度的重要評估指標之一（文章待發）。通常，INF-γ誘導的自身免疫反應是通過介導下游誘導基因的功能來實現的。近年來，有研究顯示INF-γ及其誘導的下游基因在病毒感染性疾病特別是HFMD 的發病中具有重要作用。已經證實，ISGs 在機體內可放大INF-γ 信號，激活適應性免疫反應，發揮抗病毒和免疫調節作用，但其具體機制尚不清楚。

近年來，JAK/STAT 信號通路的激活，在對抗病毒感染方面起到十分重要的作用［10］。研究已經證實，IFN-γ 可介導JAK/STAT 信號通路的激活，IFN-γ首先與靶細胞上受體結合，發生二聚體化后，再與細胞表面的受體結合，同時激活JAK-1 和JAK-2，JAK-1與受體α 亞基相互作用，JAK-2 與β 亞基相互作用，引起STAT1 的磷酸化，磷酸化的STAT1 形成二聚體INF-γ 激活因子（INF-gamma activated factor，GAF），進入核內與INF-γ 激活位點（INF-gamma activated site，GAS）反應元件結合［11］，從而啟動下游相關基因的轉錄和表達［12］。

Figure 3. The protein and phosphorylation levels of JAK1，JAK2 and STAT1 in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖3 HFMD患兒PBMCs細胞中JAK1、JAK2和STAT1的蛋白和磷酸化水平

Figure 4. The expression of STAT1 nucleoprotein in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖4 HFMD患兒PBMCs中STAT1核蛋白的表達

本研究發現，HFMD 患兒外周血OAS1 基因的表達明顯高于正常對照組，并且隨著HFMD 病情從mHFMD 到sHFMD 逐漸加重，OAS1 基因的表達進一步顯著升高，這提示了OAS1 基因可能參與了HFMD的發生發展。OAS1屬于OAS 家族，是病毒感染先天反應的免疫蛋白，OAS1 的C 末端可以激活潛在的RNase L，調節核糖核酸酶L的抗病毒活性，導致病毒RNA 的降解，抑制病毒復制［13-14］。本研究在體外培養的HFMD 患兒PBMCs 細胞中加入IFN-γ 進行干預，結 果 顯 示，IFN-γ 能 夠 顯 著 上調HFMD 患 兒PBMCs 細胞中OAS1基因的表達，并隨著刺激時間延長，其相對表達量也呈時間依賴性上升趨勢，這表明IFN-γ能夠通過刺激介導OAS1的表達，來放大INF-γ信號，激活機體適應性免疫反應，發揮抗病毒感染和病毒清除作用。

本研究還發現，在IFN-γ 刺激下，p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 的蛋白水平呈時間依賴性升高，而JAK1、JAK2和STAT1 蛋白表達水平的差異未見統計學顯著性；STAT1 核蛋白的表達也呈時間依賴性升高，有研究曾在人宮頸上皮細胞（End1/E6E7細胞）中證實，STAT1 可以誘導OAS1 的表達升高［15］，這提示IFN-γ 可能是通過激活JAK/STAT1 信號通路從而上調HFMD患兒OAS1表達的。

為了進一步證實JAK/STAT 信號途徑是否參與了IFN-γ 誘導的OAS1基因表達升高，本研究預先采用JAK/STAT 特異性信號通路抑制劑AG490 處理細胞后，再加入IFN-γ 進行干預。結果顯示，在IFN-γ+AG490 組p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1 和STAT1 核蛋白以及OAS1 的水平均較IFN-γ 單獨刺激組呈時間依賴性顯著降低。這說明PBMCs 細胞經AG490 處理后，IFN-γ 刺激不能引起細胞內JAK 磷酸化，STAT1蛋白的核轉位也顯著降低，IFN-γ 刺激OAS1 的表達也受到抑制，提示IFN-γ 可能是通過磷酸化JAK1、JAK2-STAT1 信號通路，并促進了STAT1 蛋白核轉位，從而誘導OAS1表達的。

綜上所述，本研究結果表明IFN-γ 可以上調HFMD 患兒OAS1基因的表達，其機制可能與激活JAK/STAT信號途徑有關。