內皮祖細胞在肺動脈高壓中的研究進展*

李晉秋， 舒 婷， 王 婧

（中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京協和醫學院基礎學院，北京100730）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是指在海平面靜息狀態下平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥20 mmHg，肺血管阻力（pul?monary vascular resistance，PVR）≥3 Wood units 的一種疾病或病理生理綜合征［1］。PH的病理特征主要是肺小血管結構和血管壁細胞功能變化導致的肺血管重塑，從而引起肺血管阻力增加，進而導致右心功能下降乃至右心衰竭，最后患者死亡［2］。內皮細胞（en?dothelial cells，ECs）功能失調是導致血管重塑的重要原因［3-4］。ECs 的功能受多種調控因子影響，其增殖、遷移和血管形成能力的改變會導致管腔狹窄、阻塞或小血管丟失［5-6］。個體出生后ECs可由內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分 化 而 來，EPCs 作為ECs 的前體細胞，在血管生成中發揮重要作用［7-9］。EPCs 的發現改變了人們對出生后血管生成過程的認識，EPCs 在各類血管疾病發生發展中的研究越來越多，為相關治療提供了新的可能。目前EPCs 與PH 的研究焦點在于循環EPCs 的移植治療，但是對循環EPCs 在PH 中的作用機制以及組織駐留EPCs在PH中的作用研究較少。本文就各類EPCs的生物學特性、在PH 中的作用以及臨床應用的研究進展進行綜述。

1 EPCs的生物學特性

EPCs 最初于1997 年由Asahara 等［10］根據細胞表面抗原CD34 和血管內皮生長因子（vascular endothe?lial growth factor，VEGF）的受體Flk-1 的表達，利用磁珠從人外周血中分離得到；在體外實驗中證實分離的EPCs 可以分化為ECs；在家兔缺血模型中觀察到，EPCs 在體內可以結合到血管生成活躍位點，促進血管生成。外周血中的循環EPCs（circulating EPCs）起源于骨髓，可以遷移到受損的血管處參與血管修復和出生后的血管新生［9］。后來陸續觀察到在血管壁和肺組織中存在組織駐留EPCs（resident EPCs），參與組織損傷修復［11-12］。

1.1 早期EPCs 將外周血或骨髓經過梯度離心分離出單核細胞層，再將單核細胞進行培養，從中分離出循環EPCs［13］。根據分離培養時間的長短可將其分為兩類：早期EPCs（early EPCs）和晚期EPCs（late EPCs）。早期EPCs 是體外培養4～7 d 分離出的紡錘形細胞，表達譜接近于造血系干細胞（CD14+/CD45+，CD31+/VE-cadherin-/CD34-）［14-15］，因此也有人將其稱為造血系EPCs（圖1）。循環血管生成細胞（circu?lating angiogenic cells，CACs）、髓系血管生成細胞（myeloid angiogenic cells，MACs）和促血管生成造血細胞（pro-angiogenic hematopoietic cells，PACs）等都是早期EPCs。

在功能上，早期EPCs 的增殖潛能低，在體外培養過程中形成集落或小管的能力弱，但是可以通過旁分泌作用減輕血管損傷，保護正常內皮細胞［14，16］，且旁分泌作用不受缺氧的影響［17］。早期EPCs 分泌的可溶性因子通過調節細胞內抗氧化防御機制和促生存信號，預防氧化應激造成的成熟ECs 凋亡［16］。除了對ECs 的調節，早期EPCs 分泌的降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）還可以抑制血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導的血管平滑肌細胞增殖［18］。

1.2 晚期EPCs 晚期EPCs 是體外培養超過1 周分離出的鵝卵石樣細胞，表達譜相較于早期EPCs 更接近于內皮細胞（CD14-/CD45-，CD31+/VE-cadherin+/CD34+）［14-15］，因此與早期EPCs 被稱為造血系EPCs 相對應，晚期EPCs也被稱為非造血系EPCs（圖1）。由于晚期EPCs 具有較強的集落形成能力，因而也被稱為內皮集落形成細胞（endothelial colony-forming cells，ECFCs）。根據ECFCs 中的醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）表達量，還可將其分為高表達ALDH 的ECFCs 和低表達ALDH 的ECFCs，且低表達ALDH的ECFCs具有更強的遷移和增殖能力［19］。

除了使用干細胞標志物（如c-Kit、CD34 等）和ECs標志物［如CD31、激酶插入結構域受體（kinase in?sert domain receptor，KDR）等］，FITC-UEA-I 和DiIAc-LDL也可以用于鑒定分離出的EPCs［20］。不同研究定義早期EPCs 和晚期EPCs 所使用的標志物各有不同（表1）［15，21-28］，給相關研究帶來了一定程度的阻礙。

Figure 1. Origin and classification of endothelial progenitor cells（EPCs）. EPCs can be divided into two catego?ries：circulating EPCs and resident EPCs. Resident EPCs exist in tissues at birth. Circulating EPCs are derived from bone marrow and can be isolated from monocytes in vitro. The spindle-shaped early EPCs which retain the markers CD14 and CD45 of hemato?poietic cells are isolated after being cultured for 4～7 d. The cobblestone-like cells isolated after in vitro culture for ＞1 week are called late EPCs. Late EPCs are CD14/CD45- cells with the potential to differen?tiate into ECs and participate in the repair of blood vessels. CACs：circulating angiogenic cells；MACs：myeloid angiogenic cells；PACs：pro-angiogenic he?matopoietic cells；ECFCs：endothelial colony-forming cells.圖1 EPCs的來源及分類

晚期EPCs 的體外增殖和血管形成能力強于早期EPCs，體內移植實驗也表明晚期EPCs更能增強缺血性腿部的毛細血管側支形成［15］。除了可以直接分化形成ECs 修復損傷血管，晚期EPCs 也可以通過外泌體發揮功能。晚期EPCs 外泌體中的促血管生成因子內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、血 管 生 成 素1（angiopoietin-1，ANG-1）等含量增加，有利于內皮新生，促進血管損傷修復［29］。此外，晚期EPCs 還可以通過外泌體刺激心臟成纖維細胞增殖和間充質-內皮轉化，促進血管形成［30-31］。早期和晚期EPCs在生物學特性上的差異使得它們在疾病發生發展和治療中發揮了不同的作用。

表1 早期EPCs和晚期EPCs標志物的比較Table 1. Comparison of the markers of early EPCs and late EPCs

1.3 組織駐留EPCs EPCs 不僅存在于外周循環中，Schniedermann 等［32］的研究檢測到在小鼠肺微循環中存在具有高增殖潛能、CD133 表達陽性的組織駐留EPCs。然而，組織駐留EPCs 的定位、鑒別及其功能尚未明確。如何鑒別循環EPCs 和組織駐留EPCs 是當前研究EPCs 面臨的一個問題。有研究利用GFP 小鼠骨髓移植對骨髓源性的循環EPCs 進行示蹤以排除循環EPCs 參與低氧誘導的肺血管損傷修復，但是沒有直接證明組織駐留EPCs 在此過程中的作用［33］。近期Iba 等［34］的研究顯示脂肪組織駐留EPCs 是非骨髓來源的，并且高表達CD157。此前也有研究報道CD157可以作為小鼠器官大動脈和靜脈組織駐留血管內皮干細胞的標志物［35］。因此，CD157 或許可以作為區分組織駐留EPCs 和循環EPCs的分子標志物之一。

2 EPCs與PH的發生發展

2.1 PH 中循環EPCs 的變化 作為一種骨髓源性細胞，當血管損傷時，循環EPCs 從骨髓中被動員起來，募集到血管損傷處，以替代功能失調的ECs，恢復缺血組織的血液灌注。但是在PH 發生發展過程中骨髓源性循環EPCs 的變化及其作用仍然存在爭議。到目前為止，對PH 患者循環EPCs 水平的評估結果依然是矛盾的。有研究顯示，在合并動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）的先天性心臟病（congenital cardiac disease，CHD）患兒中，循環EPCs 的數量是沒有PAH 的CHD 患兒的1/2，且EPCs水平與患兒mPAP呈負相關［36］。在成人PAH患者和COPD 合并PH 患者中也有循環EPCs 數量減少的 報 道［37-38］。并 且，在 野 百 合 堿（monocrotaline，MCT）誘導的大鼠PH 模型中，循環EPCs 數目也降低［39］。然而，也有研究提供了截然不同的結果，認為PAH 患者肺部叢狀損傷中的EPCs 數量和循環EPCs數量均升高［40-41］，而慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，

CTEPH）患者循環EPCs數量則無明顯變化［37］。EPCs數量變化不一致可能是因為使用不同的標志物鑒定、EPCs 類型不同或PH 類型、分期不同等，但是導致這一矛盾結果的真正原因還需要進一步探索。

除了數量變化評估結果矛盾，在PH 發生時循環EPCs 是否能被募集到受損肺部的報道也是不一致的。有的研究認為循環EPCs 并不能被募集到損傷的肺部替代損傷的肺小血管，或者被募集的數量有限［24，42］。而Harper 等［43］在MCT 誘導的PH 大鼠中移植EPCs 后，觀察到移植的EPCs 主要被募集到肺部，在循環中僅少量存在，但是這些聚集到肺部的EPCs大多在24 h內丟失。Pan等［44］的研究甚至表明，移植到MCT 大鼠模型中的EPCs 不僅可以定植于肺血管內皮，還能在肺血管內皮中持續存在超過1 周。因此，還需要更多的研究明確循環EPCs 是否能在PH發生時被募集到損傷的肺部參與血管修復，并且需要探明被募集的EPCs丟失的原因。

2.2 循環EPCs 對PH 的作用 目前對于循環EPCs在PH 中的作用持有兩種觀點。一種觀點認為循環EPCs 在PH 中起保護作用。針對PAH 的治療可以使PAH 患者下降的循環EPCs 數量有所回升［37］。可溶性鳥苷酸環化酶激動劑Riociguat 可以通過上調CTEPH 患者循環EPCs 的數量及循環EPCs 中VEGFC等血管生成相關因子的基因表達，使肺微血管內皮細胞的血管生成能力增強［27］。另一種觀點認為，循環EPCs 的功能失調是導致PH 的原因之一。特發性PAH（idiopathic PAH，IPAH）的MACs 凋亡增加，受血管內皮生長因子誘導的遷移能力降低［45］。MCT 誘導的PAH 大鼠循環EPCs 的Ca2+通道受到抑制［46］，將PAH 小鼠的骨髓移植到健康小鼠中，可以誘使健康小鼠發生PH［47］。此外，低氧使循環EPCs 的NADPH氧化酶/血管過氧化物酶1 通路信號上調，促使循環EPCs 發生氧化損傷和功能失調，從而導致PH 的內皮功能失調［48］。循環EPCs 移植到大鼠體內，在低氧條件下定植到肺泡毛細血管以及肺動脈中，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2 和BMP 受體2（BMP receptor 2，BMPR2）的表達增加，EPCs 開始不受抑制地增殖，進一步堵塞血管，從而促進了低氧誘導的大鼠PH的發生［41］。

2.3 組織駐留EPCs 對PH 的作用 組織駐留EPCs也在PH 的發生發展中發揮了一定作用。Nishimura等［33］的研究顯示，當小鼠暴露于低氧狀態下時，肺血管 內 皮 細 胞（pulmonary vascular endothelial cells，PVECs）的數量減少。低氧處理1 周后，有增殖活性的PVECs 增加，尤其是毛細血管處的PVECs，并且伴隨PVECs 表面的CD34 表達增加。而小鼠骨髓移植實驗顯示，低氧條件下骨髓來源細胞在肺內的定植較少，表明低氧條件下增殖增加的PVECs 來源可能是肺組織中的駐留EPCs 而非循環EPCs。該研究團隊同時也觀察到，在脂多糖誘導的急性呼吸窘迫綜合征小鼠模型中，肺血管損傷后PVECs增殖增加，增殖 的PVECs 表 面CD34、Flk-1/KDR 和c-Kit 表 達 較強，而Prom-1/CD133表達較弱，且骨髓移植實驗表明增殖的PVECs 主要來源于組織駐留EPCs［12］。目前關于組織駐留EPCs 的報道較少，這些研究提示或許在PH 的肺血管損傷修復過程中組織駐留EPCs 也發揮了作用，但是仍然缺乏這方面的直接證據。

3 EPCs與PH的治療

骨髓源性細胞在PH 時可遷移至肺部形成成纖維細胞、ECs和平滑肌細胞等多種細胞［49］。健康小鼠移植BMPR2-/-小鼠骨髓會上調肺微血管周圍的炎性細胞數量，促進血管肌化，進而促進PH 的發生；而給BMPR2-/-小鼠移植健康小鼠的骨髓可以治療PH［50］。將對PH 易感的BMPR2+/-小鼠的骨髓移植到野生型小鼠體內會因增加其對脂多糖誘導PH 的敏感性而發生PH；而將野生型小鼠的骨髓移植給BMPR2+/-小鼠則可以防止PH 的發生［51］。這些研究提示了骨髓源性細胞與PH 的發生相關，骨髓移植為PH 治療提供了新的思路。然而，骨髓源性細胞種類眾多，在骨髓移植治療PH 過程中發揮主要作用的細胞類型尚不清楚。循環EPCs 作為一種骨髓來源的具有一定干細胞特性的細胞，在PH 治療中具有一定的應用前景。目前關于循環EPCs 治療的研究多集中在體循環血管疾病領域，循環EPCs 移植治療PH 的基礎研究和臨床研究較少，并且治療效果存在爭議。此外，近期的回顧性研究發現，在接受過骨髓移植治療的患兒中，PH是發病率被低估且致死率高的嚴重并發癥之一［28］。因此，需要謹慎評估骨髓移植或循環EPCs移植治療PH的可行性。

3.1 EPCs 移植治療PH 的動物實驗 現有的研究表明，移植早期EPCs 對PH 的治療沒有明顯的作用：移植CACs 對MCT 誘導的大鼠PAH 無治療作用［52］；骨髓源性PACs 反而會通過5-羥色胺2B 受體信號加重PH 和肺血管硬化［53］。因此，多數EPCs 移植治療實驗使用的是晚期EPCs。

早期的研究表明，移植從大鼠骨髓中分離的EPCs 可以預防MCT 誘導的PAH，阻止右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）升高，維持肺毛細血管的連續性和微血管結構，提示在肺損傷早期，循環EPCs 有助于維持肺微血管的結構，防止肺微血管損傷，預防PAH 的發生［54］。循環EPCs移植還可以阻止MCT 誘導的PAH 繼續進展［54］，降低PAH大鼠RVSP，減輕右心肥厚情況［55］。近期研究也顯示，CTEPH 豬模型移植循環EPCs 也可以改善右心室功能，增加心室毛細血管密度［56］。盡管這些研究提示了循環EPCs 移植在PAH 治療中具有積極的作用，但是Ikutomi 等［24］的研究表明，不論是移植早期EPCs還是晚期EPCs，EPCs都不能被募集到肺部，替代損傷的肺小動脈內皮，減輕MCT 誘導的大鼠肺損傷。細胞質膜陷窩蛋白1（caveolin-1，CAV-1）敲除小鼠會患上類似PH 的心肺疾病，給CAV-1 敲除小鼠移植健康的骨髓，僅有RVSP 升高和右心肥大受到抑制，而肺血管內皮的重塑不受影響［57］。這些研究對于移植晚期EPC 治療PH 肺血管損傷的效果存在分歧，但是一般認為循環EPCs 移植對PH 右心肥厚和RVSP 升高等右心癥狀有所緩解。需要明確的是，循環EPCs 是否直接定植到并且取代受損的肺血管內皮與循環EPCs 能否促進血管修復并不矛盾，因為EPCs 可以通過旁分泌作用影響血管生成，但前提是其能夠被募集到肺組織。

除了直接移植循環EPCs，還有研究將分離出的循環EPCs 經過質粒轉染修飾后進行移植，實驗結果顯示治療效果優于直接移植EPCs。體外分離EPCs后轉染eNOS 質粒構建eNOS-EPCs，移植eNOS-EPCs比移植EPCs 更能使血流動力學改變導致的PAH（hemodynamic PAH）大鼠模型的肺動脈肌化程度和肌層厚度明顯降低，甚至恢復正常［58］。在MCT 誘導的大鼠PH 模型中，Song［39］檢測到循環EPCs 數目和血漿前列環素濃度降低，且二者存在正相關，而構建和移植環氧合酶1-前列環素合酶-EPCs，比單純移植EPCs 更能降低MCT 大鼠的RVSP，抑制右心室肥厚和肺血管壁增厚［59］。CD40 通路參與了血管炎癥的發生，MCT 處理后的大鼠血清可溶性CD40 配體（soluble CD40 ligand，sCD40L）水平升高，sCD40L 可以損害EPCs 的遷移、黏附、增殖和血管生成功能，因此，移植轉染了CD40 shRNA 的EPCs 可以更好地改善MCT 大鼠的血流動力學并逆轉血管重構［44］。此外，將轉染了人缺氧誘導因子1α 的EPCs 移植到采用頸總動脈和頸靜脈吻合術建立的PAH家兔模型體內2 周后，家兔mPAP 降低，右心室肥厚和肺血管重構被逆轉，肺小動脈數目增加［60］。由此可見，將循環EPCs 進行基因修飾后再移植不失為一種優化EPCs移植治療的方案。此外，Xu 等［61］的研究還表明，敲除E2F 轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）可以通過降低丙酮酸脫氫酶激酶2 和4 來增加EPCs的氧化代謝，降低乳酸生成，從而促進EPCs 向ECs分化，因此抑制E2F1 也對EPCs 移植治療具有積極作用。

3.2 EPCs 移植治療PH 的臨床試驗 EPCs 移植治療PH 的臨床試驗使用患者自體外周血來源的EPCs（peripheral blood-derived EPCs，PB-EPCs）。目前一些相關的臨床試驗已完成，尚有研究正在進行（表2），但是關于EPCs 移植治療PH 成功的臨床試驗報道很少。2007 年浙江大學首次報道了自體PB-EPCs移植治療PH 的臨床研究結果［62］。該研究納入了31名成年IPAH 患者，抽取患者外周血進行體外培養，分離出PB-EPCs 并擴增，再將患者的自體PB-EPCs通過靜脈輸注回患者體內，12 周后評估治療效果。患者對自體PB-EPCs 移植治療表現出良好的耐受性，且與常規治療的患者相比，6 min 步行距離（6-min walk distance，6MWD）、mPAP、PVR 和心輸出量（cardiac output，CO）都有所改善［62］。2008 年該研究團隊再次報道了在13 名兒童PAH 患者中進行自體PB-EPCs 移植的臨床試驗，得到了同樣的結果［63］。此后，加拿大、墨西哥等國先后在www.clinicaltrials.gov網站注冊并開展了3項評估EPCs移植治療PH的有效性及安全性的臨床試驗（表2）。Granton 等［64］將7 名患者自體PB-EPCs 經體外分離、培養并轉染eNOS 質粒后，重新經肺動脈導管輸送回患者體內，患者耐受性良好，短期內沒有血流動力學惡化的證據，并且在接受治療后6MWD 明顯增加，但是有1 例嚴重終末期患者出院后立即死亡。

表2 www.clinicaltrials.gov網站注冊的EPCs治療PH臨床試驗Table 2. Registered clinical trials of treating PH with EPCs on www.clinicaltrials.gov

現有已公布結果的臨床試驗結果表明，多數PH患者對自體PB-EPCs 移植治療耐受性良好，且能改善患者的mPAP、PVR、CO 等相關指標。然而，這些臨床研究都是短期的（12～24 周），EPCs 移植治療是否長期有效并不清楚。不同的研究納入的患者年齡和性別組成以及PH 臨床分級不同，對患者EPCs 的分離培養時間和鑒定所用的標志物不同，在此過程中造成的差異使得EPCs 移植治療的有效性和安全性無法得到統一的評估。此外，對EPCs 的臨床前研究尚不透徹，今后需要更多的動物實驗和臨床前瞻性研究為臨床試驗提供依據。

4 展望

EPCs 作為ECs 的前體細胞，在個體出生后的血管生成和損傷血管修復過程中發揮了重要的作用。因此，有大量的研究探索了EPCs 在心血管疾病中的作用及其在臨床治療中的應用前景。但是，EPCs在PH 發生發展中的基礎研究和EPCs 移植治療PH 的臨床研究尚不完善，還面臨著諸多問題。

首先，EPCs 本身的定義和鑒別標志物尚無統一的標準。什么樣的細胞可以被認為是EPCs，如何鑒別循環EPCs 和組織駐留EPCs 等問題亟待解決。其次，循環EPCs 是否能在PH 發生時被募集到受損的肺部參與血管修復以及循環EPCs 移植治療的效果如何都沒有定論。明確EPCs 的分類和移植方法或許有助于分析結果產生差異的原因。此外，組織駐留EPCs 對PH 發生發展影響的研究還在起步階段，機制研究欠缺，并且循環EPCs 和組織駐留EPCs 對PH 的影響是協同作用還是某一方占主導地位尚不明確。對組織駐留EPCs 的定位、鑒別以及功能的研究可以為PH 發病機制的探究和治療提供新思路。EPCs 在PH 治療中的應用前景是公認的，但是針對EPCs 與PH 的基礎研究還有很大的完善空間，需要更多的證據支撐臨床應用研究的開展。