應(yīng)用六西格瑪統(tǒng)計(jì)技術(shù)對A型肉毒毒素中間品量器的分析

魏子昊，陸儉，苗承輝，張雪平，張錫云

（蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司，甘肅 蘭州 730046）

量器（measuring container）是指具有一定容積并可作為計(jì)量器具的容器。根據(jù)量器工作用途的不同，可分為量入式量器和量出式量器。量入式量器是測量注入量器（內(nèi)壁干燥）內(nèi)液體體積的量器。量出式量器則是用于測量從量器內(nèi)部排出液體體積的量器［1］。在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常被用到的分度吸量管（以下簡稱吸管）、滴定管、移液器等就屬于量出式量器［2］。

注射用A 型肉毒毒素（衡力?）是我國自主開發(fā)的第一個用于臨床的微生物毒素。至今已上市20 余年，用于治療眼瞼痙攣，面肌痙攣，斜視等肌張力障礙性疾病和暫時性改善中重度眉間紋等醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域［3］。注射用A 型肉毒毒素（衡力?）每瓶（100 u） 活性藥用成分（API） 含量僅為5 ng,1 ng=10-9g，含量極其微量，100 u 制品中每ng 毒素的活性單位含量（u/ng）高達(dá)21～24［4］。基于每毫升API 用量的準(zhǔn)確性、價(jià)值高的特性，其管理者必須在每個環(huán)節(jié)中對肉毒毒素中間品的取用進(jìn)行嚴(yán)格、精細(xì)的控制。

本文針對A 型肉毒毒素中間品取用時所用的量器（移液器、分度吸量管）應(yīng)用六西格瑪（6σ）管理方法結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，通過對測量得出的結(jié)果進(jìn)行分析，確定了最佳量器組合及其影響因素［5-7］，對指導(dǎo)實(shí)際操作和制定相關(guān)的控制措施提供理論依據(jù)，對制品的質(zhì)量提升提供支持?jǐn)?shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

注射用水為蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司制備；無菌中管；分度吸量管；移液器槍頭。XP603S 電子天平梅特勒托利多公司（經(jīng)甘肅省計(jì)量院計(jì)量）；移液器（經(jīng)第三方計(jì)量）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 量器實(shí)際量取體積檢測方法 用量器吸取額定體積的容納介質(zhì)（注射用水）至一次性中管，隨后在分析天平中稱重，所得重量（注射用水+空管）減去空管重量（預(yù)先稱重）即為量器的量取重量。將注射用水密度近似認(rèn)為1 g/mL，則量器量取注射用水的重量即為體積。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用Minitab 軟件將測量值（量取體積）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，根據(jù)結(jié)果得出分析結(jié)論。

1.2.3 量器線性與偏倚分析 實(shí)驗(yàn)使用2 種品牌最大量程為10 mL 的移液器交換搭配2 種品牌的槍頭、使用最大量程為10 mL 的吸管搭配三通吸球（以下簡稱吸球），依次量取2、6、10 mL 注射用水并測量實(shí)際量取體積，研究2 種10 mL 量器的線性與偏倚情況，實(shí)驗(yàn)分為a、b、c、d、e 共5組。見表1。

表1 量器線性與偏倚分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 吸管變異源分析 根據(jù)2 種量器的線性與偏倚分析結(jié)果，選擇無偏倚的吸管作為優(yōu)化對象。對其進(jìn)行單因素分析，雙因素交叉、嵌套設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析得到影響吸管量取效果的變異源。

①吸管單因素分析。選擇兩名不同人員使用吸管+吸球量取10 mL 注射用水，以研究不同人員使用吸管時的差異。

②吸管雙因素交叉設(shè)計(jì)分析。選取吸球、吸管為兩個主要因素。選取同品牌1#吸球、2#吸球兩個水平，以量取10 mL 注射用水為指標(biāo)，進(jìn)行交叉設(shè)計(jì)（見表2），測試同品牌同型號吸管間的差異。

③吸管雙因素嵌套設(shè)計(jì)分析。選取實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)次數(shù)為兩個主要因素。選取實(shí)驗(yàn)人員1、2、3三個水平，選取實(shí)驗(yàn)次數(shù)1、2、3 三個水平，以量取10 mL 注射用水為指標(biāo)，進(jìn)行雙因素嵌套設(shè)計(jì)（見表3），對其進(jìn)行變異源分析。

表2 雙因素交叉設(shè)計(jì)因素與水平

表3 雙因素嵌套設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果

2.1 量器線性與偏倚分析

a 組實(shí)驗(yàn)的整體偏倚為-0.0577333，故可判斷其在2 mL、6 mL、10 mL 處均有偏倚，且參考值為6 mL 時偏倚嚴(yán)重存在；因線性回歸的斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.268），故線性方程不成立，偏倚不可修正。

b 組實(shí)驗(yàn)的整體偏倚為-0.0647333，整體偏移百分率為0.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），所以判定整體存在偏倚，且在6 mL 處偏倚嚴(yán)重；線性回歸的斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.245），線性方程不成立，故偏倚不可修正。

c 組實(shí)驗(yàn)整體存在偏倚，偏倚值為-0.102067，偏倚百分率為90%；線性方程成立，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），因此該實(shí)驗(yàn)組為線性偏倚，實(shí)際使用該量器時，可根據(jù)偏倚的線性回歸擬合方程y（偏倚）=-0.008250x（參考值）-0.05257 計(jì)算出偏倚值，然后對測量結(jié)果進(jìn)行修正。

由于d 組實(shí)驗(yàn)的整體偏倚值為-0.0721333，整體偏倚百分率為60%，其在2 mL、6 mL、10 mL均存在偏倚；同時線性回歸斜率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），線性方程成立。故d 組實(shí)驗(yàn)為線性偏倚，可根據(jù)方程y=-0.006075x-0.03568 對實(shí)際的測量結(jié)果進(jìn)行修正。

在e 組實(shí)驗(yàn)中2 mL、6 mL、10 mL 處對應(yīng)P值分別為0.698、0.068、0.933，整體偏倚對應(yīng)P值0.182，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明10 mL 吸管量取時未發(fā)生偏倚。見圖1、表4。

圖1 量器線性與偏倚分析

表4 量器線性與偏倚分析

移液器與槍頭的組合實(shí)驗(yàn)全部存在偏倚，其中1 號移液器搭配不同的槍頭均不能建立線性關(guān)系，故1 號移液器不能通過線性方程對其發(fā)生的偏倚進(jìn)行修正。2 號移液器搭配不同的槍頭的組合同樣全部存在偏倚，但同時可通過各自建立的線性關(guān)系方程對其偏倚進(jìn)行修正。以上說明不同槍頭（吸液嘴）對移液器的量取結(jié)果存在影響，而同一廠家移液器與槍頭組合的量取結(jié)果優(yōu)于不同廠家的組合。這與羅志東［8］的研究結(jié)果一致。

吸管與吸球的組合則均無偏倚，且在量取2 mL、6 mL、10 mL 液體時的平均值在所有組合中也最接近真值，故作為進(jìn)一步優(yōu)化的量器。

2.2 吸管變異源分析

2.2.1 吸管單因素分析 不同人員操作相同吸管的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以得出，實(shí)驗(yàn)人員1與實(shí)驗(yàn)人員2的平均值與真值（10.000 mL）相差不明顯；同時根據(jù)平均值標(biāo)準(zhǔn)誤、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)及中位數(shù)分析，實(shí)驗(yàn)人員1的結(jié)果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)人員2，這與實(shí)際情況相符（實(shí)驗(yàn)人員1多年操作吸管，而實(shí)驗(yàn)人員2的經(jīng)驗(yàn)相對較少）。而由配對t檢驗(yàn)可知，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.36,P=0.244），表明不同實(shí)驗(yàn)人員使用相同吸管量取液體的結(jié)果雖有差異但不顯著。

表5 描述性統(tǒng)計(jì)表

2.2.2 吸管雙因素交叉設(shè)計(jì)分析 由表6 結(jié)果可知。吸球間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F吸球=0.008,P吸球=0.928＞0.05）；吸管間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F吸管=11.312,P吸管=0.004＜0.05）；同時由圖2 可見，影響吸管雙因素交叉實(shí)驗(yàn)的差異主要來自吸管（分差分量51.5%）和隨機(jī)誤差（分差分量48.5%）。以上數(shù)據(jù)說明在使用吸管量取液體時，不同的吸球不會對吸管的量取結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，而使用不同的吸管則對量取結(jié)果影響顯著。同時隨機(jī)誤差也是顯著影響吸管量取效果的重要因素，應(yīng)在實(shí)際的操作中分析并優(yōu)化。

2.2.3 吸管雙因素嵌套設(shè)計(jì)分析 圖3 中實(shí)驗(yàn)人員多變異圖的平均值連線呈平滑趨勢，說明實(shí)驗(yàn)人員及實(shí)驗(yàn)次數(shù)這兩個變異源對測量值影響不顯著。同時由表7 可知，不同實(shí)驗(yàn)人員間差異不顯著（F實(shí)驗(yàn)人員=3.258,P實(shí)驗(yàn)人員=0.049≈0.05）；實(shí)驗(yàn)次數(shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F實(shí)驗(yàn)次數(shù)=0.029,P實(shí)驗(yàn)次數(shù)=0.971＞0.05）。因此可以判斷，不同的操作人員、操作批次對同一量器（吸球與10 mL 吸管的組合）量取10 mL 液體的結(jié)果無明顯的影響，有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

表6 吸管雙因素交叉設(shè)計(jì)分析

圖2 吸管量取值變異源的pareto 圖

圖3 測量值對于實(shí)驗(yàn)人員的多變異圖

表7 吸管雙因素嵌套設(shè)計(jì)分析

3 討論

有研究者在采用稱重法換算體積的說明中指出，在稱重時要注意水的蒸發(fā)對稱量結(jié)果的影響［9］。本文則是將注射用水由被測量器轉(zhuǎn)移至干燥的一次性中管（每次實(shí)驗(yàn)前以相同條件烘干）后馬上旋蓋封口，同時放液操作也避免量器外壁的殘留水影響稱量結(jié)果。而稱量用分析天平則通過計(jì)量確保結(jié)果的真實(shí)性。稱量操作在壓力、溫度穩(wěn)定且獨(dú)立的稱量間內(nèi)進(jìn)行，加之注射用水幾乎無雜質(zhì)的特性使其密度最大程度的接近1 g/mL。因此基于以上實(shí)驗(yàn)條件，保證用稱量法能夠有效的檢測得到量器的實(shí)際量取體積。

根據(jù)量器線性與偏倚的分析結(jié)果，吸管較移液器的量取結(jié)果更接近真實(shí)值，移液器均發(fā)生偏倚有可能是使用頻率高、日常維護(hù)不到位所造成。有學(xué)者指出日常操作方式和維護(hù)程度均會對移液器的量取結(jié)果造成影響［10-11］。不同吸管間的量取結(jié)果會存在差異，這主要是因?yàn)槊扛茉谥圃鞎r很難做到完全一致，包括吸管直徑、吸管嘴、刻度標(biāo)識位置的一致性等。因此在量取一個目標(biāo)體積時應(yīng)始終使用同一吸管以減少差異。而使用吸管時產(chǎn)生的隨機(jī)誤差則需要進(jìn)一步在實(shí)際操作中逐步分析、優(yōu)化，并制定有效的控制措施。