赤脛散指紋圖譜的建立及其3種化學成分含量的測定*

王彬宇， 黃家宇， 杜秋瑩， 陳思憶， 魯婷婷， 李莉*

(貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

赤脛散又名花蝴蝶、散血草，為蓼科蓼屬植物赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.var.sinenseHemsl.)的干燥根莖，是西南少數民族地區民間常用藥[1-2]，其性寒，味苦、澀，用于治療跌撲損傷、癰癤腫毒及風濕痹痛等，具有清熱解毒、活血舒筋等功效[3-5]。赤脛散現收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》2003年版中，其鑒別方法為與對照藥材薄層色譜法(thin layer chromatography ，TLC)定性鑒別，無含量測定項[6]。目前，國內外對赤脛散的質量研究較少，難以全面評價藥材質量[7-9]。赤脛散主要含有酚酸、揮發油類成分[10-14]，其中沒食子酸具有抗炎抗氧化的藥理作用[15]；鞣花酸和3,3′-二甲基鞣花酸具有抗菌抗病毒活性[16-18]，毒副作用小，與赤脛散功能主治一致。基于此，本實驗通過建立赤脛散高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜，并結合化學計量學手段[19-26]進行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析，同時對沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸的含量進行測定，為其質量控制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材來源 赤脛散藥材17批均為本省野生(表1)，經貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根莖。

表1 17批赤脛散樣品來源信息Tab.1 Source information of 17 batches of P. runcinatum

1.1.2主要試劑與儀器 沒食子酸對照品(批號110831-201204，中國食品藥品檢定研究院)，鞣花酸對照品(批號GZDD-0272，純度≥98%，貴州迪大科技有限責任公司)，3,3′-二甲基鞣花酸(批號160810，北京北納創聯生物技術研究院)，水為純凈水，磷酸為分析純，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；ULtiMate 3000 型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，MS105DU型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1色譜條件 色譜柱為ACE C18-AR(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脫為0～6 min、5%～15%A，6～20 min、15%～17%A，20～45 min、17%～30%A，45～60 min、30%～70%A。

1.2.2對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為1.12、1.11及0.96 g/L的單一對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇稀釋制成混合對照品溶液(每升含沒食子酸39.20 mg、鞣花酸255.30 mg及3,3′-二甲基鞣花酸28.80 mg)。

1.2.3供試品溶液的制備 取赤脛散藥材粗粉(過60目篩)約0.3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，37 ℃超聲(功率150 W，頻率40 kHz)處理45 min，放冷，70%甲醇補足減失質量，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.4指紋圖譜的建立 (1)精密度試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計算各共有峰相對標準偏差(rlative sandard deviation ，RSD)值。(2)重復性試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“1.2.1”項下色譜條件進行進樣測定，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計算各共有峰RSD值。(3)穩定性試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，于0、2、4、8、12及24 h時按“1.2.1”項下色譜條件進行進樣測定，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計算各共有峰RSD值。(4)赤脛散指紋圖譜的建立：分別取17批赤脛散藥材粉末，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進行進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)軟件，將S1樣品色譜圖設為參照圖譜，中位數法，時間窗寬度0.2 min，生成對照圖譜，進行指紋圖譜的建立、共有峰的指認與相似度分析。

1.2.5含量測定 (1)線性關系考察：取“1.2.2”項下混合對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，制成系列濃度混合對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，以各成分的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制線性標準曲線，得到3種成分各自線性范圍及相關系數(r)。(2)精密度試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，以“1.2.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積，計算3種成分RSD值。(3)重復性試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，以“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算3種成分RSD值。(4)穩定性試驗：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，于0、2、4、8、12、24 h時以“1.2.1”項下色譜條件進行進樣測定，記錄峰面積，計算3種成分RSD值。(5)加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的同一批赤脛散藥材粉末(編號S9)0.15 g，共6份，分別置于100 mL具塞錐形瓶瓶中，加入各單一對照儲備液適量，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進行進樣測定，記錄峰面積，并計算3種成分的加樣回收率及其RSD值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 23.0軟件，采用組間聯接法、選擇歐式平方距離為度量，對17批赤脛散共有峰峰面積數據進行聚類分析；應用SIMCA 14.1軟件對17批赤脛散樣品共有峰峰面積進行主成分分析，繪制主成分分析得分圖(以特征值>1作為標準，計算其累積方差貢獻率與特征值)，同時進行正交偏最小二乘判別分析，得到得分圖[以變量重要性投影值(very important person，VIP)值>1作為標準，得到可能引起赤脛散樣品間質量差異的主要標志性成分]。

2 結果

2.1 赤脛散藥材指紋圖譜的建立和方法學考察

2.1.1指紋圖譜方法學 精密度試驗中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.09%，相對峰面積RSD<2.58%，說明儀器精密度良好。重復性試驗中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.18%，相對峰面積RSD<2.97%，說明方法重復性良好。穩定性試驗中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.23%，相對峰面積RSD<2.92%，表明樣品在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.1.2赤脛散藥材指紋圖譜的建立和共有峰的指認 經多點校正后進行色譜峰重疊匹配，標定了19個共有峰(圖1)。將樣品對照指紋圖譜與對照品的保留時間和紫外吸收光譜比對，指認了3種成分，分別為2號峰(沒食子酸)、11號峰(鞣花酸)、19號峰(3,3′-二甲基鞣花酸)，其中11號峰(鞣花酸)為所有樣品中均含有，分離度較好，保留時間適中且峰面積最大，因此選其作為參照峰(S，圖2)。對17批赤脛散樣品進行相似度計算，結果17批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.768～0.997(表2)，表明各產地樣品間整體質量存在一定的差異。

注：1～19為共有峰編號。圖1 赤脛散樣品(17批)HPLC指紋圖譜疊加圖(S1～S17)及對照圖譜(R)Fig.1 HPLC fingerprints(S1～S17)and control fingerprint(R)of 17 batches of P. runcinatum

注：1～19為共有峰編號。圖2 對照品和對照指紋圖譜色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of substance control and control fingerprint

表2 赤脛散樣品(17批)相似度評價結果Tab.2 Results of similarity evaluation of 17 batches of P. runcinatum

2.2 化學模式識別分析

2.2.1聚類分析 當距離為15時，可將17批樣品聚為2類，其中Ⅰ類包括S1～S6、S8、S9、S15及S17，Ⅱ類包括S7、S10～S14及S16。見圖3。

圖3 赤脛散樣品(17批)聚類分析圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis for 17 batches of P. runcinatum

2.2.2主成分分析 主成分分析結果顯示，以特征值>1作為標準時，得到5個主成分，其累積方差貢獻率為89.427%；可將17批赤脛散樣品分為2類，其結果與聚類分析一致，S1～S6、S8、S9、S15及S17大多集中于一、四象限，S7、S10～S14及S16集中于二、三象限。見表3和圖4。

表3 主成分分析方差貢獻率與特征值Tab.3 Variance contribution rate and eigenvalue and of principal component analysis

注：t[1]為主成分1，t[2]為主成分2。圖4 赤脛散樣品(17批)主成分分析Fig.4 Score scatter plot of principal component analysis of 17 batches of P. runcinatum

2.2.3正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析結果表明，17批樣品可分為2類，結果與聚類分析、主成分分析一致；模型參數R2X(cum)=0.832，R2Y(cum)=0.980，均>0.5，說明模型穩定且預測性好；繪制VIP圖，以VIP>1作為標準，色譜峰9、8、14、4、5、11、7、13、12及10為引起赤脛散樣品間質量差異的主要標志性成分。見圖5和圖6。

注：t[1]為主成分1，t[2]為主成分2。圖5 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析Fig.5 Score scatter plots of orthogonal partial least square-discriminant analysis of 17 batches of P. runcinatum

圖6 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in Orthogonal partial least square-discriminant analysis model of 17 batches of P. runcinatum

2.3 3種成分含量測定與方法學考察

2.3.1含量測定方法學考察結果 線性關系考察中，沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸在各自范圍內線性關系良好(表4)；精密度試驗中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為0.38%、0.05%及2.01%，說明儀器精密度良好；重復性試驗中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.06%、0.18%及0.32%，說明方法重復性良好；穩定性試驗中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.80%、0.56%及0.17%，表明樣品在室溫放置24 h內穩定性良好；加樣回收率試驗中，平均回收率分別為103.48%、96.90%及98.61%，RSD值均<2.21%，說明加樣回收率良好(表5)。

表4 各成分線性范圍與回歸方程Tab.4 Regression equation and linear range of 3 components

表5 各成分加樣回收率試驗結果Tab.5 Results of recovery test of 3 components

2.3.23種成分含量測定結果 含量測定結果表明，不同產地赤脛散中3種成分含量差異較大，見表6。

表6 赤脛散樣品(17批)3種成分含量測定結果Tab.6 Results of content determination of 3 components of 17 batches of samples

3 討論

本實驗前期分別考察了8種提取溶劑(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及100%甲醇)，其中70%甲醇提取的樣品色譜峰豐富，峰型較好，能更全面地反映藥材信息；考察了不同樣品提取方式(超聲、回流)和提取時間(30、45、60及90 min)，結果表明超聲與回流各成分含有量無明顯差異，提取45 min后樣品有效成分含量較為接近，出于操作簡便及提取效率的考慮，最終選定超聲提取45 min；考察多種流動相體系梯度洗脫結果(乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液及甲醇-水)，結果表明乙腈-0.1%磷酸溶液分離度較好、出峰快、色譜峰較多；考察了不同柱溫(25、30、35及40 ℃)，30 ℃時出峰時間合適，峰型良好；采用DAD檢測器收集200～400 nm全波長掃描下的紫外吸收圖譜，觀察3D圖譜發現254 nm下各測定成分色譜峰的響應均較高，分離效果良好，基線穩定。因此，最終實驗條件定為采用70%甲醇為提取溶劑，超聲提取45 min，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相、檢測柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm。

中藥材化學成分復雜，本實驗前期采用超高效液相色譜—離子阱飛行時間高分辨質譜聯用儀，得到赤脛散藥材中化合物分子量信息，將碎片離子信息與現有文獻比對[27-29]，經初步鑒定后與對照品紫外吸收光譜比對，進行化學成分的確定。本實驗采用HPLC法建立了赤脛散的指紋圖譜，標定了19個共有峰，指認出3種有效成分并進行含量測定。17批赤脛散樣品與對照圖譜相似度為0.768～0.997，各化學成分相對保留時間較為均一，但相對峰面積RSD值較大，不同批次間的同一成分含量也有所不同，說明樣品間化學成分相似，但含量差異較大。通過聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析等化學計量學方法[23-26]對17批赤脛散指紋圖譜進行綜合分析，建立樣品分類模型，發現了明顯聚類趨勢，將17批樣品聚為2類，如鞣花酸含量為1.180 4～15.212 8mg/g，Ⅰ類樣品鞣花酸含量在5.655 5mg/g以上且均高于Ⅱ類；以VIP值>1作為標準，篩選出10種引起赤脛散質量差異的主要標志成分，Ⅰ類樣品該10種成分峰面積大多高于Ⅱ類；從藥材粉末外觀上看，Ⅰ類樣品為棕黃色，Ⅱ類樣品為棕紅色，與聚類分析結果一致。由于其均為野生，藥材產地、生長環境、海拔高度、儲藏條件及時間等多種因素均可能導致藥材化學成分降解或轉化，為保證赤脛散質量，用藥過程中應規范藥材來源、采收時間、儲藏條件并關注該10種成分的質量變化，可將其作為藥材質量評價指標。

綜上所述，本研究建立了赤脛散HPLC指紋圖譜并同時測定3種有效成分含量，方法快速、操作簡便、分離度好、化學成分信息豐富，指紋圖譜定性結合有效成分定量，可彌補現有標準與含量測定方法的不足，對赤脛散藥材進行整體性評價并反映其內在質量，為進一步質量控制及藥材開發提供參考。