魯甸縣青花椒中麻味素的提取工藝研究

王 銳，安 婷，楊紅霞，熊汝琴

（昭通學院 化學化工學院，云南 昭通657000）

花椒（Zanthonxylum bungeanum Maxim）為蕓香科、花椒屬落葉灌木或小喬木[1]。花椒作為我國傳統調味品，辛麻味是其主要特征風味，也是其品質評價的重要指標。研究人員對花椒果皮中的化學成分做了大量的研究，其化學成分主要為揮發油、生物堿、麻味素、木脂素、香豆素等[2]。此外，還含有少量的甾醇類、三萜類、黃酮甙類、芳香烴類等化合物[3]。花椒最有特色的成分是其麻味素，主要是一些酰胺類化合物。該化合物大多數為鏈狀不飽和脂肪酰胺，其中以山椒素類為代表，具有強烈的刺激性，其它則為連有芳環的酰胺[4]。現代藥理研究表明，酰胺類物質具有多種生物活性功能，如麻醉、鎮痛、抑菌、殺蟲、祛風、除濕等[5]。

花椒具有喜水肥、耐瘠薄、抗旱、耐寒等特性，適合大部分地區種植[6]，在我國有著悠久的栽培歷史，種植面積廣泛。云南省是我國重要的花椒種植基地之一，昭通市則是云南省花椒產量的第一大主產區，種植有青花椒（Zanthoxylum schinifolium Zucc）和紅花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）等品種。其中青花椒種植面積超過6.67 萬公頃，約占全省的53%，主要分布于魯甸縣、永善縣、彝良縣、巧家縣、大寨鄉等鄉鎮[7]。魯甸縣因其獨特的氣候條件，青花椒產量高，且品質優良，其顆粒碩大，麻味純正、濃郁，備受人們喜愛，青花椒已成為當地人民的經濟支柱產業。

目前，國內外對青花椒麻味素的檢測方法沒有進行統一，缺乏對應的標準品。同時，在花椒麻味等級的評判方法和評判標準等方面的評價體系也不健全。人們在花椒麻味物質的成分分析和藥理作用等方面做了一定研究[8]，但在花椒麻味素含量方面的研究較少，從而導致花椒產業發展緩慢。筆者通過對青花椒中麻味素的提取工藝研究為魯甸花椒產業的發展和花椒品質的鑒定提供理論依據，進而為魯甸青花椒建立一種科學、合理、有效的品質評價方法。

1 儀器及材料

1.1 儀器

RE-52AA 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SK5200LHC 超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；YB-150 高速多功能粉碎機（永康市速峰工貿有限公司）；DHG-9023A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；CP214電子天平（上海奧豪斯有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水真空泵（天津華鑫儀器廠）等。

1.2 材料和試劑

青花椒于當年8月中旬采購自魯甸縣梭山鄉。

氫氧化鈉（廣東省化學試劑工程技術研究開發中心）；鄰苯二甲酸氫鉀（天津市風船化學試劑科技有限公司）；甲醛（濟南源茂化工有限公司）等試劑均為分析純。

2 實驗方法

麻味素是由含氮的酰胺類物質組成，但青花椒中的蛋白質、生物堿等物質也有含氮成分，采用乙醇作為提取溶劑可以減少雜質和干擾物質對實驗結果的影響，故選用乙醇作為提取青花椒中麻味素的浸提溶劑[9]。在所得浸膏中滴加一定量體積分數50%硫酸溶液，可將浸膏中麻味素的氮轉變為NH4+,該離子能用滴定法間接測出其含量，而干擾物質中的氮則與體積分數為50%硫酸反應生成N3+，N3+不對實驗造成影響。由于所需測定的NH4+酸性太弱，不能用NaOH 溶液直接滴定，所以選用甲醛法間接測定青花椒中麻味素的提取率[10]。其化學方程式為:

4NH4++6HCHO=（CH2）6N4H++3H++6H2O

該法使含氮成分物質的酸性被加強，從而使其可采用NaOH 溶液進行滴定[11]。花椒麻味素和（CH2）6N4H+反應的化學計量系數比為1，故生成的（CH2）6N4H+量與花椒麻味素的量等同。

2.1 原料預處理

將新鮮、顆粒飽滿的青花椒放于鼓風烘箱中，在65 ℃下進行干燥，去除籽粒后，置于粉碎機中進行粉碎，過60 目篩，密封保存備用。

2.2 單因素試驗制備浸膏

以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助提取法[12-15]，考察在不同超聲時間、料液比、乙醇體積分數條件下，制備青花椒麻味素浸膏。

2.2.1 不同超聲輔助提取時間下制備浸膏

準確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 體積分數95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，分別超聲（53kHz）浸提10、20、30、40、50 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進行稱量。

2.2.2 不同料液比下制備浸膏

準確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL錐形瓶中，分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入體積分數95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，超聲（53kHz）浸提30 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進行稱量。

2.2.3 不同乙醇濃度下制備浸膏

準確稱取5.0000 g 青花椒粉末5 份，置于250 mL 錐形瓶中，分別加入100 mL 體積分數55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，超聲（53kHz）浸提30 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進行稱量。

2.3 銨態氮的轉化

準確稱取“2.2”項中所得浸膏0.6000 g 置于125 mL 圓底燒瓶中，分別加入6.00 mL 一定體積分數的乙醇溶液和4.00 mL 體積分數50%的硫酸溶液，搖勻，溶解浸膏，待溶解完全后置于沸水浴中反應30 min，使脂肪酸酰胺充分地轉化為銨態氮，再加入3.00 g 活性炭，沸水浴中脫色反應30 min，趁熱過濾，濾液冷卻加蒸餾水定容至100 mL，保存待用。

2.4 麻味素的測定

準確量取“2.3”項溶液10.00 mL 于100 mL錐形瓶，滴加2 滴甲基紅指示劑，用0.65 mol/L，NaOH 溶液進行滴定消除多余的酸，使溶液顏色由紅色變為黃色。然后加入體積分數18%甲醛溶液1.00 mL，并滴加2 滴酚酞指示劑，振蕩搖勻讓其反應5 min，再用已知準確濃度的NaOH 溶液進行滴定，溶液終點顏色由黃色變為橙紅色，記錄所消耗的NaOH 標準溶液體積，平行滴定3 次，求平均值，并代入以下公式，計算青花椒中麻味素的提取率。

式中，2.2696 為系統誤差矯正系數；C 為NaOH 標準溶液的濃度（mol/L）；為3 次滴定消耗NaOH 標準溶液的平均體積（mL）；14.0067 為氮的相對分子質量；m1為花椒粉末質量（g）；m2為浸膏總質量（g）；m3為取用浸膏質量（g）。

2.5 正交實驗設計

根據單因素試驗的結果，以料液比（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數（C）作為研究因素，設計正交實驗因素及水平，如表1所示。

表1 正交實驗因素及水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment

3.結果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 超聲時間

在固定料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分數為95%的條件下，以不同超聲時間進行單因素實驗，并計算出不同超聲時間下各組青花椒中麻味素的提取率，結果如圖1所示。

圖1 超聲時間對青花椒中麻味素提取率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由圖1 可知，超聲時間在10 ～30 min 時，青花椒中麻味素的提取率隨超聲時間的延長而增加；超聲30 min 時，麻味素的提取率達最大，為16.63%；之后隨著超聲時間的延長，麻味素提取率反而降低。產生這一現象的原因是由于超聲時間短，麻味素從青花椒中浸提不完全；當超聲30 min時，青花椒中的麻味素提取充分；再繼續延長超聲時間，提取物中的雜質增多，且浸出的麻味素也會因長時間超聲，其結構受到破壞，從而導致青花椒中麻味素提取率降低，因此確定超聲30 min為宜。

3.1.2 料液比

固定乙醇體積分數為95%、超聲30 min，以不同料液比進行單因素實驗，并計算出不同料液比下各組青花椒中麻味素的提取率，結果如圖2所示。

圖2 料液比對青花椒中麻味素提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由圖2 可知，當料液比為1∶10 ～1∶20（g/mL）時，麻味素的提取率逐漸升高；當料液比為1∶20（g/mL）時，青花椒麻味素的提取率最大，為13.43%；之后隨著料液比的增加，青花椒麻味素的提取率降低。產生這一現象的原因是料液比較小時，青花椒中麻味素溶出不充分，增大料液比促進了青花椒中麻味素的溶出。料液比為1∶20（g/mL）時，青花椒中麻味素的溶出達到飽和，再繼續增大料液比，會造成溶劑浪費，所以確定料液比1∶20（g/mL）為宜。

3.1.3 乙醇體積分數

固定料液比1∶20（g/mL）、超聲30 min，以不同體積分數的乙醇溶液進行單因素平行實驗，并計算出不同體積分數的乙醇溶液下各組青花椒中麻味素的提取率，結果如圖3所示。

由圖3 可知，乙醇體積分數在55%～75%時，青花椒中麻味素的提取率隨乙醇體積分數的增大而升高；當乙醇體積分數增大至75%時，麻味素提取率最高，為17.72%；之后隨著乙醇體積分數的增大，青花椒中麻味素的提取率逐漸降低。這是由于乙醇體積分數較小時，溶液極性較大，不利于青花椒中麻味素的提取；而乙醇體積分數較大時，溶液極性降低，青花椒中一些脂溶性成分溶出，抑制麻味素的提取，當乙醇體積分數增大至95%時，麻味素的提取率急劇降低為8.21%。根據“相似相溶”原理，確定乙醇體積分數75%為宜。

3.2 正交試驗

根據“2.5”實驗按L9（33）設計正交試驗，試驗結果如表2所示。

表2 正交實驗結果與分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal experiment

分析表2 實驗數據可得，影響青花椒中麻味素提取的主次因素順序為C＞B＞A；青花椒中麻味素的最佳提取工藝為A2B1C1，即料液比1∶20（g/mL）、超聲20 min、乙醇體積分數65%，青花椒中麻味素的提取率最高。

3.3 驗證實驗

分別準確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL 錐形瓶中，按正交試驗篩選出的最佳工藝條件進行提取，將提取液減壓過濾，真空濃縮得到浸膏。根據“2.3”和“2.4”項進行測定和計算，結果如表3所示。

表3 驗證實驗結果Tab 3 Verification experiment results

由表3可知，在超聲時間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數65%條件下，進行青花椒中麻味素提取驗證實驗，麻味素提取率分別為23.45%、23.10%、23.81%， 平均值為23.45%，RSD 值為0.29%。結果表明，由正交實驗篩選的提取工藝條件是有效、可行的。

4 結果與討論

采用超聲波輔助提取青花椒中的麻味素，研究了超聲時間、料液比、乙醇體積分數3 個因素對青花椒中麻味素提取的影響。由正交試驗結果可知，影響青花椒中麻味素提取的主次因素順序為乙醇體積分數＞超聲時間＞料液比，最佳提取工藝為超聲20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數65%，青花椒中麻味素的提取率最高，為23.45%。

青花椒中的麻味素有著較高的藥用價值，其檢測方法較多，如高效液相色譜法、氣質聯用法等，這些儀器設備價格昂貴，所需實驗環境要求較高，且缺乏相應的標準品，不易推廣。采用超聲波輔助提取，甲醛滴定法測定花椒中的麻味素，其操作簡捷、高效，所需儀器、試劑成本低，在實際應用中更便于推廣。本研究結果為昭通魯甸縣花椒的產業化開發提供了實驗依據。