野生昭通獼猴桃中維生素C的提取及含量測定

程立君，王世敏，田 虹，賈臣夢，劉健君

（昭通學院 農學與生命科學學院，云南 昭通 657000）

昭通獼猴桃（Actinidia rubus Levl.）屬獼猴桃科（Antinidiacese）獼猴桃屬（Actinidia），一種漿果類藤本植物，又名藤梨、奇異果等，《本草綱目》中記載：“其形如梨，其色如桃，而獼猴喜食，故有諸名”[1]。獼猴桃的口感好，營養價值高，深受人們的歡迎，其中維生素C（VC）的含量普遍高于一般的水果，享有 “世界珍果”之稱。VC 又名抗壞血酸，一種含6 個碳原子的酸性多羥基化合物，是無色無味的片狀晶體，易溶于水[2]。它是人體所需要的不可或缺的一部分，是維持人體機能的一種重要的維生素[3]，缺乏VC 會導致多種病癥的發生，嚴重時將導致壞血病、心臟及脾臟損傷等疾病[4]。

昭通市氣候適宜獼猴桃的生長，野生獼猴桃資源豐富，其中昭通獼猴桃分布較廣，果實酸甜可口，果肉營養豐富[2]，開發利用前景較好，但目前開發利用程度較低。本研究對野生昭通獼猴桃中VC 超聲提取的方法進行了優化，并對其含量進行了測定，以期為將來的研究開發提供參考。

1 實驗材料

1.1 材料

野生獼猴桃2019年10月采集于昭通市昭陽區盤河鄉。

1.2 試劑

鉬酸銨、草酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、抗壞血酸、偏磷酸、醋酸、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、95%乙醇、葡萄糖等均為分析純。

1.3 儀器與設備

AX224ZH/E型電子天平（奧豪儀器有限公司）、紫外可見分光光度計 UV-2450（日本島津有限公司）、UV759 型紫外可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）、Km-1030C 型超聲波清洗機（廣州科潔盟實驗儀器有限公司）、HL/T20MM 型立式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器有限公司）、BCD-470WDPG 型冰箱（青島海爾股份有限公司）、RE-52AA 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、HH.S21-8 數顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、202-0 型臺式干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司），LGJ-10D 型真空冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 樣品的提取流程

VC 的提取工藝流程如下：昭通獼猴桃→去皮→研磨→超聲提取→過濾→得待測液。

稱取3.0000 g 去皮獼猴桃置于研缽中，加入10 mL 草酸（0.05 mol/L）-EDTA（0.15 mol/L）溶液和10 mL 水充分研磨后，超聲提取后定容至250 mL，搖勻后過濾，加入少許活性炭吸附色素后再次過濾，即得提取液。

2.2 VC 含量的測定

VC 含量測定采用鉬藍比色法，參照柳青等人[5]的方法進行。以VC 質量濃度為橫坐標（X）、吸光值為縱坐標（Y）建立多糖標準曲線。標準曲線（見圖1）的線性回歸方程為y = 0.016x - 0.002，R2=0.9990，VC 對照品質量濃度的線性范圍為0 ～14 μg/mL，依據標準方程計算樣品中VC 濃度，依據公式（1）計算樣品中還原型VC 含量。

圖1 705 nm 下VC 標準曲線

式中：W—還原型VC 含量（mg/100 g）；C—待測液中還原型VC 的質量濃度，mg/mL；V1：提取液總體積（mL）；V2：測定時樣品體積（mL）；M—獼猴桃樣品重量，g。

2.3 單因素實驗

2.3.1 料液比對VC 提取量的影響

分別設置料液比（m:v）為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30、1∶36 g/mL 六個梯度，按2.1 的方法，在30℃下超聲提取30 min 后過濾，濾液按2.2 方法測定VC 含量，每組設3 次重復。

2.3.2 提取時間對VC 提取量的影響

在篩選得到的最佳料液比基礎上，分別設置提取時間5、10、15、20、25、30 min 六個梯度，按2.1 的方法，在30℃下超聲提取后過濾，濾液按2.2 方法測定VC 含量，每組設3 次重復。

2.3.3 提取溫度對VC 提取量的影響

在篩選得到的最佳料液比和提取時間基礎上，分別設置提取溫度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃六個梯度，按2.1 的方法，超聲提取后過濾，濾液按2.2 方法測定VC 含量，每組設3 次重復。

2.4 響應面法優化實驗

在單因素實驗的基礎上，利用Design Expert軟件進行Box-Behnken 響應面實驗設計（見表1），以料液比A、提取時間B、提取溫度C 為自變量，以野生昭通獼猴桃中VC 含量為響應值（Y），進一步優化昭通獼猴桃VC 的提取，每組設3 次重復。

表1 響應面設計的因素與水平表

3.結果與分析

3.1 單因素實驗結果分析

3.1.1 不同料液比對VC 提取量的影響

不同料液比對野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見圖2。由圖2 可知，不同料液比條件下，昭通獼猴桃中VC 的提取量之間存在顯著差異（F=121.5429，P＜0.01）。隨著料液比的升高提取量隨之增加，當料液比為1∶24 時，VC 提取量達到最高（121.66 mg/100 g），之后料液比繼續升高，VC提取量略有下降，表明提取的最佳料液比1∶24。

圖2 料液比對VC 提取量的影響

3.1.2 不同提取時間對VC 提取量的影響

不同提取時間對野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見圖3。由圖3 可知，提取時間對昭通獼猴桃中VC 的提取量有顯著影響，方差分析結果顯示F=148.6085，P＜0.01。隨著提取時間的延長VC 提取量逐漸上升，超聲提取25 min 時，VC 提取量達到最高（125.06 mg/100 g），之后維持穩定。

圖3 提取時間對VC 提取量的影響

3..1.3 不同提取溫度對VC 提取量的影響

不同提取溫度對野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見圖4。由圖4 可知，不同提取溫度條件下，昭通獼猴桃中VC 的提取量之間存在顯著差異（F=580.9722，P＜0.01）。VC 提取量隨著提取溫度的上升出現先增加后下降的趨勢，當提取溫度20℃時提取量最低，為114.42 mg/100 g；提取溫度在30℃時，VC 提取量達到最高（130.13 mg/100 g），可能是因為超聲提取時低溫下VC 浸出率較低，但溫度過高VC 又容易出現氧化。

圖4 提取溫度對VC 提取量的影響

3.2 響應面實驗結果分析

3.2.1 響應面實驗結果

基于單因素篩選實驗的結果，以料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3 個因素為響應面變量，以昭通獼猴桃中VC 提取量為響應值，利用Box-Behnken 軟件進行響應面實驗設計及實驗結果見表2。

表2 響應面設計及實驗結果

3.2.2 回歸模型的建立及方差分析

對表2 中響應面實驗數據進行回歸擬合，得到野生昭通獼猴桃中VC 提取量與料液比、提取時間、提取溫度之間的多元回歸方程為：Y=139.82-0.77A-8.85B+0.99C-2.78AB-2.01AC-7.96BC-21.37A2-11.40B2-14.88C2。該模型的方差分析結果見表3。

表3 響應面二次模型方差分析結果

由表3 可知， 該模型的F 值為11.38，P=0.0021（P＜0.01），表明回歸方程模型是可靠的；決定系數R2為0.9360，表明模型可以解釋93.60%的總體變異情況，回歸模型相關性較高。根據回歸方程的方差分析結果可知，該模型一次項B 變量的P=0.0077＜0.01，A 變量和C 變量的P 值分別為0.7588 和0.6931，均大于0.05，表明超聲提取時間對昭通獼猴桃中VC 提取量有極顯著影響，而料液比和提取溫度對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著，各因素對VC 提取量的影響順序為提取時間＞提取溫度＞料液比。交互項AB、AC 的P值分別為0.4391 和0.5722，均大于0.05，表明對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著；BC 項的P 值為0.0431，小于0.05，表明對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響顯著。二次項A2、B2、C2的P 值分別為0.0003、0.0107、0.0028，表明三者對昭通獼猴桃中VC 提取量均具有顯著影響。

3.2.3 交互作用分析

兩因素之間交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響見圖5。曲面中相同VC 含量所對應的各因素值在底面上形成曲線，即為等高線圖。等高線的形狀可以清晰地反映出兩因素交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量影響的強弱。等高線越接近圓形，說明交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響越弱；等高線越是接近橢圓形，說明交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響越強；在等高線的中心處附近有極值條件的存在。從圖5（a）可以看出，當料液比值保持不變時，昭通獼猴桃中VC 的提取量隨著提取時間的上升而增大，曲面的斜率較大；當提取時間穩居不變時，隨著液料比值的增大，VC 的提取量曲面斜率較小，說明提取時間對昭通獼猴桃中維生素C 提取量的影響較為顯著。從圖5（b）可以看出液料比值與提取溫度交互作用形成的曲面較平緩，說明其交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著。由圖5（c）可以看出提取時間和提取溫度的交互作用形成的曲面較陡峭，說明其交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響顯著。

圖5 各因素交互作用對昭通獼猴桃中VC 提取量的影響

3.2.4 驗證實驗

根據Design Expert 軟件分析，在料液比為1∶24、提取時間22 min、提取溫度29℃的條件下，野生昭通獼猴桃中VC 提取量的預測值為141.65 mg/100 g。實際操作條件下，測得野生昭通獼猴桃中VC 的含量為139.85 mg/100 g，與理論值相差1.8 mg/100 g，實驗值與理論預測值相差不大，證實了該模型在實際預測上的可用性，說明野生昭通獼猴桃中VC 提取工藝條件就可以用響應曲面法進行優化。

4.結論與討論

本實驗通過在單因素實驗的基礎上，應用Box-Behnken 響應面實驗設計對昭通獼猴桃的超聲提取工藝進行優化來提高維生素C的提取量。單因素實驗結果表明：料液比為1∶24 時，VC 提取量達到最高（121.66 mg/100 g）；超聲提取25 min 時，VC 提取量達到最高（125.06 mg/100 g）；當提取溫度在30 ℃時，VC 提取量達到最高（130.13 mg/100 g）。在此基礎上進行響應面優化后的最佳工藝條件為：料液比為1∶24，提取時間為22 min，提取溫度為29℃，在此工藝條件下，維生素C 提取量達139.85 mg/100 g。張維等人對分布在湖南地區的26 個紅心獼猴桃品種中維生素C 測定結果顯示其平均含量為106.04 mg/100 g。[6]李躍紅等人對11 個不同產地的紅心獼猴桃中維生素 C 測定結果其顯示平均含量118.18 mg/100 g。[7]本實驗采用的野生昭通獼猴桃中VC 含量高于兩者研究報道中的平均值，表明昭通獼猴桃具有較好的開發價值，本研究為野生昭通獼猴桃的開發利用提供了基礎數據。