昭通市四縣區白魔芋和花魔芋中蛋白質含量的測定研究

葉 坪，何宣婷,何 嵋，彭 瀟，張文艷，師 睿

（昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000）

1 引言

魔芋屬于被子植物門、單子葉植物綱、天南星科、魔芋屬，是一種經濟價值和保健價值都非常高的多年生草本植物，又名蛇六谷、雷星、鬼芋、蛇頭草、蛇包谷[1]等。我國是魔芋種植大國，種植總面積多達十萬多公頃，魔芋資源主要分布在云南、貴州、四川、陜南和湖北等地的山區。魔芋產業是這些地區的重要支柱產業[2]。在昭通市11 縣區大面種植的主要有白魔芋（Albus）和花魔芋（Akoac）兩種。魔芋產業有巨大的發展前景，在藥理價值方面，魔芋是我國的一種古典醫藥[3]，除具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、減肥作用外，還具有胃腸道保護功能、通便、止血等作用[4]。在食用價值方面，可以制作成魔芋豆腐、魔芋餅干、魔芋粉條、魔芋糕等味道鮮美，口感宜人的食品，也可作為添加劑應用于各類保健食品、美容食品和兒童營養食品之中[5]。在生態價值方面，魔芋的規模化種植，能提高植被覆蓋度、減少水土流失、保護生態環境[6]。

魔芋塊莖中主要含葡甘聚糖（簡稱KGM）、蛋白質及多種氨基酸、淀粉、生物堿、神經酰胺、微量元素、維生素等成分[7]。蛋白質是生命的物質基礎，是人體中不可缺少的組成成分[8]。蛋白質與人體的營養代謝、氧氣運輸、信息交流、細胞結構、增強免疫和遺傳物質等相關[9]，具有構成機體、修復組織、構成酶和激素等活性物質、供給機體能量等生理功能，也是人體中氮的唯一來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[10]。

考馬斯亮藍法是目前實驗室中最常見、靈敏度最高的一種測定蛋白質含量的方法[11]。考馬斯亮藍法測定蛋白質具有成本低、快速簡捷、精密度高、顯色靈敏、重現性好及干擾物質少[12]等優點，可檢測的蛋白質數量低達1 ug[13]，是目前靈敏度最高的蛋白質測定法，可作為微量蛋白質測定的首選方法[14]。蛋白質是一項質量和資源評價的重要指標，用一種快速、準確、方便的方法來檢測蛋白質含量是必不可少的[15]。魔芋化學成分種類很多且含量豐富，但目前研究最多的是葡甘聚糖，對其他成分研究應用較少且造成資源浪費，現對昭通市彝良、鎮雄、巧家、永善四縣區花魔芋和白魔芋中水溶性蛋白質進行提取及含量的測定，旨在為今后昭通地區的魔芋開發利用提供部分理論數據支持和參考依據[16]。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

將采自彝良、鎮雄、巧家、永善四縣的新鮮白魔芋和花魔芋洗凈切成小片，放入40 ℃恒溫干燥箱烘20 小時，用粉碎機粉碎過60 目篩后，制得魔芋粉，裝入樣品瓶中備用。

2.2 實驗儀器

2.3 實驗藥品

表2 實驗藥品

2.4 實驗方法

2.4.1 溶液的配制

蛋白質標準溶液：稱取牛血清白蛋白10.10 mg于100 mL 燒杯中，加入蒸餾水溶解，移入100 mL容量瓶，加蒸餾水定容[17]。得0.1010 mg/mL 蛋白質標準溶液，放入4 ℃冰箱中保存。

考馬斯亮藍G-250 溶液：稱取100.5 mg 考馬斯亮藍G-250 于500 mL 燒杯中，依次加入95%乙醇50 mL，85%磷酸100 mL，溶解后移入1 L 容量瓶中，最后用蒸餾水定容[18]，得0.1005 mg/mL 考馬斯亮藍G-250 溶液（棕紅色），過濾后置于棕色試劑瓶中保存備用。

2.4.2 最大吸收波長的確定

用吸量管吸取蛋白質標準溶液0.5 mL 于10 mL容量瓶中，然后加入考馬斯亮藍G-250 溶液5 mL，最后加蒸餾水定容，搖勻后用分光光度計在波長540～640 nm 下測其最大吸收波長，每隔20 nm 測定一次，結果見圖1。

圖1 最大吸收波長結果

圖1 表明在波長580～600 nm 有最大吸收波長，然后在580～600 nm 之間每隔2 nm 測定一次，結果見圖2。

圖2 最大吸收波長結果

圖2 表明，在波長588 nm 時，測定的吸光度值最大，達到0.499，因此選擇588 nm 為最大吸收波長。

2.4.3 標準曲線的制作

以蛋白質標準溶液制作標準曲線，用7 個10 mL的容量瓶做好標記，分別加入標準溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍G-250 溶液，加蒸餾水定容，搖勻靜置10 min。用722 型分光光度計在波長588 nm 下以0 mL 的標準液容量瓶為空白對照比色，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖3。

圖3 標準曲線制作結果

圖3 標準曲線的方程為：Y=0.0557X+0.0829，牛血清蛋白含量（X）和吸光度（Y）的相關系數R2=0.9995，表明方程的線性良好可應用。

2.4.4 蛋白質含量測定方法

將提取液用4000 r/min 的離心沉淀器離心15 min，用吸量管吸取0.2 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入考馬斯亮藍G-250 溶液5 mL，加蒸餾水定容，室溫條件下反應10 min，在588 nm 處測定吸光度，平行做3 個重復，取其吸光度的平均值代入標準曲線方程，求出提取液濃度，代入下列公式計算魔芋中蛋白質的含量。

2.4.5 單因素試驗

以提取溫度、提取時間和提取料液比三個因素作為對象來進行實驗，以確定魔芋中水溶性蛋白質的最佳提取條件。依據查閱的參考文獻，綜合考慮基礎條件設定為：提取料液：1∶35（g/mL）、提取時間50 min，提取溫度40 ℃。

2.4.5.1 最佳提取溫度的確定

用電子分析天平分別稱取8 份永善縣白魔芋粉1 g 置于燒杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸餾水，攪拌均勻后放入恒溫水浴鍋中，溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，浸提50 min，按上述1.4.4 測定方法進行測定。

2.4.5.2 最佳提取時間的確定

用電子分析天平分別稱取8 份永善白魔芋粉各1 g，置于燒杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸餾水，攪拌均勻后放入40 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提20、30、40、50、60、70、80、90 min，按上述1.4.4 測定方法進行測定。

2.4.5.3 最佳提取料液比的確定

用電子分析天平分別稱取6 份永善白魔芋粉各1 g，置于燒杯中，分別按料液比（g/mL）為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、加入蒸餾水，攪拌均勻后放入35 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提60 min，按上述1.4.4 測定方法進行測定。

2.4.6 樣品蛋白質含量的測定

用電子分析天平分別稱取彝良、鎮雄、巧家、永善四縣的白魔芋粉和花魔芋粉各1 g 于燒杯中，按上述最佳提取條件浸提，得到蛋白質提取液，按上述1.4.4 測定方法進行測定。

3 實驗結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 最佳提取溫度單因素實驗結果

按2.4.5.1 實驗方法進行實驗，測定吸光度，計算出蛋白質含量，結果見圖4。

圖4 最佳提取溫度單因素實驗結果

由圖4 可知，蛋白質含量隨著提取溫度的升高，呈先增加后降低的趨勢，溫度在25 ℃～35 ℃之間，測得的蛋白質含量隨溫度升高而增加，是因為分子的擴散速率隨溫度的升高而增加，有利于蛋白質分子的溶解[19]。當溫度為35 ℃時，測得的蛋白質含量最高，達到2.00%，而后隨著溫度的升高，測得的蛋白質含量開始降低，這是由于溫度逐漸升高，蛋白質的結構開始發生變化，水溶性蛋白質含量逐漸降低。因此，提取溫度選擇35 ℃為宜。

3.1.2 最佳提取時間單因素實驗結果

按2.4.5.2 實驗方法進行實驗，測定吸光度，計算出蛋白質含量，結果見圖5。

圖5 最佳提取時間單因素實驗結果

由圖5 可知，在20～40 min 之間，測得的蛋白質含量隨提取時間的增加而呈現緩慢上升的趨勢。在40～60 min 之間，隨提取時間的增加而呈快速上升的趨勢。當提取時間為60 min 時，測得的蛋白質含量達到最大值，達到1.98%。60 min 后隨著時間的延長測得的含量逐漸降低。為了縮短工時減少能耗，提取時間選擇60 min 為宜。

3.1.3 最佳提取料液比單因素實驗結果

按2.4.5.3 實驗方法進行實驗，測定吸光度，計算出蛋白質含量，結果見圖6。

圖6 最佳提取料液比單因素實驗結果

圖6可知，提取料液比在1∶25～1∶35（g/mL）之間，隨著提取液增加，測得水溶性蛋白質的含量呈現快速上升的趨勢。當提取料液比達到1∶35（g/mL）時，測得蛋白質的含量最高，達到1.91%。提取料液比在1∶35～1∶50（g/mL）之間，測得蛋白質的含量開始降低，但變化趨勢較為緩慢，這是由于一定體積的提取液已將有效成分基本溶出[20]，提取料液比選擇1∶35（g/mL）為宜。

3.2 樣品的測定結果

按2.4.4 實驗方法進行4 縣區花魔芋和白魔芋的蛋白質含量的測定，各縣的花魔芋和白魔芋均平行做3 個重復，計算其平均含量，結果見圖7。

圖7 魔芋水溶性蛋白質含量測定結果

由圖7 可知，在不同地區同一品種魔芋中所含的水溶性蛋白質含量有差異，同一地區花魔芋和白魔芋中的水溶性蛋白質含量也有差異，但差異不大。

測得四個縣區白魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是永善縣，達到2.14%。含量的高低順序是：永善縣（2.14%）＞巧家縣（2.07%）＞彝良縣（1.89%）＞鎮雄縣（1.87%）

四個縣區花魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是鎮雄縣，達到2.12%。含量的高低順序是：鎮雄縣（2.12%）＞彝良縣（1.98%）＞巧家縣（1.93%）＞永善縣（1.83%）。

3.3 測定方法的檢驗

3.3.1 精密性實驗

用吸量管分別吸取6 份蛋白質標準溶液各0.2 mL于10 mL 容量瓶中，然后按上述2.4.4 測定方法進行測定，計算RSD 值，如表3所示，得RSD =1.54%＜5%，表明實驗儀器精密度較好。

表3 精密度實驗結果

3.3.2 穩定性實驗

稱取永善縣白魔芋粉1 g，按上述最佳提取條件浸提得到蛋白質提取液，然后按上述2.4.4 測定方法進行測定，每隔10 min 進行1 次測定，連續測定6 次，記錄其吸光值變化，觀測其穩定性。如表4所示可知，在顯色1 小時內吸光度值比較穩定，RSD=0.11%＜5%，表明1 小時內樣品溶液穩定性較好[21]。

表4 穩定性實驗結果

3.3.3 重復性實驗

分別稱取6 份永善縣白魔芋粉各1 g，按上述最佳提取條件浸提得到蛋白質提取液，然后按上述2.4.4 測定方法分別進行測定，記錄其吸光度值，計算RSD 值。如表5所示，得RSD=1.64%＜5%，表明該方法重復性較好。

表5 重復性實驗結果

3.3.4 回收率試驗

取6 份已知含量的白魔芋粉各1 g，按照上述最佳提取條件浸提，得到蛋白質提取液。用吸量管吸取0.1 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入蛋白質標準溶液0.1 mL，然后按上述2.4.4 測定方法分別進行測定，計算回收率及RSD 值，如表6所示，得RSD=2.25%＜5%，表明該方法準確度較高[22]。

表6 回收率實驗結果

4 結論與分析

4.1 本論文采用水浸提法對昭通4 個縣區魔芋中水溶性蛋白進行提取，通過單因素實驗確定了魔芋中水溶性蛋白質的最佳提取條件為：提取溫度35 ℃，提取時間60 min，提取料液比1∶35（g/mL）。

4.2 采用考馬斯亮藍法測定魔芋中水溶性蛋白質含量，結果表明不同產地魔芋中水溶性蛋白質含量有所差別，同一地區花魔芋和白魔芋中的水溶性蛋白質含量也有差異，但差異不大。

4.3 測得四個縣區白魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是永善縣，達到2.14%。含量的高低順序是：永善縣（2.14%）＞巧家縣（2.07%）＞彝良縣（1.89%）＞鎮雄縣（1.87%）

4.4 四個縣區花魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是鎮雄縣，達到2.12%。含量的高低順序是：鎮雄縣（2.12%）＞彝良縣（1.98%）＞巧家縣（1.93%）＞永善縣（1.83%）。

4.5 本試驗精密性、穩定性、重復性、回收率良好，測定方法相對準確。