白背葉楤木根皮中總黃酮提取工藝

張新軍，張明強，包劉媛，馬仲煉

（昭通學院 農學與生命科學學院，云南 昭通 657000）

白背葉楤木（Aralia chinensis L.var.nuda Nakai），為五加科楤木屬楤木(Aralia chinensis)的原變種植物，楤木屬植物全世界共有40 余種，主要分布在亞洲，少量產(chǎn)于北美洲，我國的楤木屬植物資源極其豐富，多達30 余種，主要分布在云南、貴州、四川、遼寧、湖北、河北、廣東、安徽、江西等省[1]，其中白背葉楤木在云南昭通的大關、彝良、永善、威信等縣有野生，同時也有大量人工種植，在春季3-5月和冬季反季生產(chǎn)中，由頂芽萌發(fā)形成的鮮嫩芽苞，即為刺老苞，是珍貴的野生木本蔬菜[2-3]。

近年來，研究人員從楤木屬植物中分離出多糖、有機酸、黃酮類、香豆素、木脂素、苯丙烯類、木質素、生物堿、揮發(fā)油、芳香化合物等數(shù)百種單體化合物，另外還有許多微量元素及其它無機礦物質元素[4-5]。現(xiàn)代研究結果表明：黃酮對人體的生物代謝活動具有密切的關系，具有抗氧化、降低膽固醇、改善血液循環(huán)等多種功能[6]。學者已從長白楤木、刺老苞、龍牙楤木等楤木屬植物中提取出總黃酮并開展了藥理方面的研究[7-12]。然而白背葉楤木相關方面的研究未見報道，故本文以白背葉楤木根皮為材料，測定總黃酮含量及優(yōu)化提取工藝，旨在為白背葉楤木資源合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

白背葉楤木試驗材料于2019年5月，取自于云南省昭通市昭陽區(qū)蘇家院騾馬河水庫旁密林中。

蘆丁標準品（（中國藥品生物制品鑒定所，批號：100080-201811）；無水三氯化鋁、95%乙醇、99.97%無水乙醇等，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、UV759 紫外可見分光光度儀（上海奧譜勒儀器有限公司）、粉碎機、真空抽濾機（SHZ-D（Ⅲ））、博訊電熱鼓風干燥箱、水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、容量瓶、圓底燒瓶、抽濾瓶、冷凝管、移液槍（力辰科技）、移液管、玻璃棒、漏斗等。

2 方法

2.1 樣品選擇與處理

用自來水將白背葉楤木根洗凈，剝下根皮→切成小片段（1-3 cm）→在108℃下殺青1 h →85℃下烘24 h →粉碎機粉碎1-2 min →精確稱取原料粉末→倒入圓底燒瓶中→加入對應濃度的乙醇溶液→水浴加熱回流濃縮提取→過濾→樣品處理溶液（裝瓶標記待用）。

2.2 黃酮標準液的制備定

準確稱取0.0100 g 蘆丁標準品，用體積分數(shù)為50%的乙醇超聲溶解5 min，并定容至50 mL 的容量瓶中，得到質量濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標準品溶液，裝入棕色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 線性關系考察與黃酮得率計算

2.3.1 蘆丁標準曲線的建立

分別移取質量濃度0.2 mg/mL 蘆丁標準品溶液0 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、2 mL、2.25 mL、2.5 mL 于25 mL 容量瓶中，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，50%的乙醇溶液定容，搖勻，避光顯色30 min 后，于360 nm 波長下測定吸收值，然后以吸光度為縱坐標，蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標，繪制出標準曲線（如圖1）。結果以吸光度A 對濃度C 作最小二乘法回歸，標準曲線方程為：Y=0.1207X-0.002，R2=0.9994，線性范圍為0.0000～2.5000 mg/L。

圖1 蘆丁標準曲線

2.3.2 白背葉楤木根皮中的總黃酮得率計算

按上述2.1 的試驗方法進行操作，得到樣品溶液后，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，分別加0%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液定容，搖勻，避光顯色30 min 后于紫外分光光度計中測定其吸光度，按下列的公式計得算出楤木根皮中的總黃酮得率：

式中C 為標準曲線方程計算所得的總黃酮質量濃度（mg/L），V 為反應體系總體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M 為樣品質量（mg）。

2.4 穩(wěn)定性試驗

按上述2.1 的試驗方法進行操作，提取得樣品處理液；精確吸取2 mL 的樣品處理液于25 mL 容量瓶中，加入10%AlCl3溶液1 mL，用50%的乙醇定容至刻度線，于室溫條件下每隔10 min 測定一次吸光值，分析RSD 值。

2.5 精密度試驗

按上述2.1 的試驗方法進行操作，提取得到一定濃度的樣品溶液6 份，各加入10%AlCl3溶液1 mL，用對應濃度的乙醇定容至刻度線處并充分搖勻，連續(xù)測定6 次其吸光度，然后分析數(shù)據(jù)的RSD 值。

2.6 加樣回收率試驗

按上述2.1 的試驗方法進行操作，得到一定濃度的樣品處理液，然后精確吸取已知總黃酮含量的樣品溶液6 份，分別加入質量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標準品和10% 的AlCl3溶液，避光顯色30 min 后；按上述操作方法在紫外分光光度計中測定其吸光度，然后依據(jù)蘆丁標準曲線計算出總黃酮含量，最后根據(jù)加樣回收公式計算出其回收率。

3 試驗結果與分析

3.1 穩(wěn)定性試驗結果

按2.4 試驗方法得出，供試品溶液完全顯色的最佳時間為30 min，且在4 h 內保持穩(wěn)定，其RSD等于2.06%，如表1所示，說明此試驗方法具有較好的可行性。

表1 穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

3.2 精密度試驗結果

通過精密度試驗得其RSD 值等于0.21%（n=6），表明該儀器精密度良好，測出的數(shù)據(jù)可靠性較好，結果見表2。

表2 精密度試驗

3.3 加樣回收率試驗結果

在完成加樣回收試驗操作步驟后，進行吸光度測定，并依據(jù)蘆丁標準曲線計算出其總黃酮含量，然后根據(jù)回收率公式計算出加樣回收率，RSD值為0.14%，由此可知，本方法具有良好的加樣回收效果，如表3所示。

表3 加樣回收率

3.4 單因素試驗結果分析

3.4.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取效果的影響

當液料比50∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取時間30 min，隨乙醇體積分數(shù)的逐漸增加，白背葉楤木總黃酮提取率呈先增后減的變化趨勢，其中50%乙醇溶液提取率最高，提取率為1.12%，而濃度為95%的乙醇提取效果最差，提取率僅為0.75%。產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能是由于楤木根皮中的其他成分比黃酮類化合物更易溶于95%的乙醇溶液中，影響了黃酮類化合物的溶出，結果見表4。

表4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取效果的影響

3.4.2 液料比對總黃酮提取效果的影響

當乙醇體積分數(shù)50%、提取溫度為70℃、提取時間30 min，由表5 可得：隨著液料比的增加，其黃酮提取率呈先增后減的變化趨勢；當料液比為1∶90 g/mL 時，其提取率最佳，為1.19%；原因可能是，當楤木根提取液中的料液比為1∶90 g/mL時，總黃酮得率已接近飽和。所以，再增大其料液比，提取率也無明顯變化，還可能會導致其它成分的大量溶出，對目標物的溶出造成不利的影響。故以下單因素試驗中的料液比均選擇1∶90 g/mL。

表5 液料比對總黃酮提取效果的影響

3.4.3 提取溫度對總黃酮提取效果的影響

為探究不同溫度對白背葉楤木根皮中總黃酮提取率的影響，固定乙醇體積分數(shù)為50%，液料比為90∶1（mL/g），提取時間為30 min，設置了5 個不同溫度，結果如表6所示。

表6 不同提取溫度對總黃酮提取效果的影響

由表6 可知，隨著提取溫度的不斷增加，總黃酮提取率也呈不斷遞增的趨勢，當提取溫度為97.8℃時，提取率最大，為1.45%。原因可能是隨著溫度不斷升高，溶液越接近沸點，故使其溶質與溶劑的接觸就更充分，溶劑的滲透作用也越強，相關溶質的細胞壁和細胞膜破壞度越強，所以提取效果也就越好。

3.4.4 提取時間對總黃酮提取效果的影響

固定乙醇體積分數(shù)為50%，液料比為90∶1（mL/g），提取溫度為97.8℃，觀察提取時間對總黃酮提取率的影響，結果如表7所示，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率呈先增后穩(wěn)的變化趨勢。當提取時間為240 min 時，其黃酮的提取率就達到了最大，為1.67%。

表7 不同提取時間對總黃酮提取效果的影響

3.5 提取白背葉楤木根皮中總黃酮的正交試驗

由單因素試驗所得出的最佳試驗條件，進行L9,34正交試驗，因素水平表設計如表8所示。

表8 正交試驗因素水平表

正交試驗（L9,34）結果如表，在影響總黃酮提取率的4 個因素中，溫度影響最大，其余三個因素對總黃酮提取率的影響大小依次為：液料比＞乙醇濃度＞提取時間。提取總黃酮的最佳工藝參數(shù)組合為A1B3C3D3，即：乙醇濃度40%、液料比1∶100 g/mL、提取溫度97.8℃、提取時間3.5 h，在這個最佳試驗條件下，測得總黃酮提取率為1.86%。

表9 白背葉楤木根皮中總黃酮提取的正交試驗結果表

4 結論

白背葉楤木為五加科楤木屬的珍貴木本蔬菜，在昭通分布廣泛，其春季嫩莖葉稱為刺老苞，為餐桌上的高等鮮蔬，深受老百姓喜愛，同時，白背葉楤木根皮具有較高的藥用價值。其同屬長白楤木、遼東楤木、云南楤木根莖葉中均含有豐富的黃酮類物質，而作為高原特色藥食兼用植物白背葉楤木未見相關報道，本實驗以白背葉楤木根皮為材料，分別研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對總黃酮得率的影響，在單因素研究基礎上，通過正交實驗確定了黃酮的最佳提取條件組合。結果表明各因素對白背葉楤木根皮中總黃酮提取率的影響程度有差異，影響最大的是提取溫度，其次是液料比、乙醇體積分數(shù)和提取時間，最佳提取條件組合為乙醇體積分數(shù)為40%、液料比1∶100 g/mL、提取溫度97.8℃、提取時間3.5 h，在這個最佳實驗條件下，黃酮提取率最高為1.86%。