葉面噴施蘋果酸對水稻Cd積累特性的影響

王惠君，薛衛杰，張昕，張長波，黃永春，任興華，劉仲齊*

（1.農業農村部產地環境污染防控重點實驗室，農業農村部環境保護科研監測所，天津300191;2.湖南省湘潭市農業科學研究所，湖南 湘潭411134）

我國大約有65%人口以稻米為主食，稻米的營養成分與人類健康密切相關[1]。當水稻生長在Cd污染土壤中時，Cd能在其根、莖、葉以及籽粒中大量積累，不僅影響水稻的生長發育，而且還嚴重影響稻米品質，并經食物鏈危及人類和動物的健康[2]。全世界大約有2.35×1012m2的耕地被重金屬污染[3]，在有害金屬中，Cd是一種流動性強且毒性大的重金屬[4?5]；在我國南方酸性土壤中，即使稻田土壤Cd含量在0.3 mg·kg?1以下，也有可能生產出Cd超標的稻米[6?7]。因此，有效控制稻米Cd積累的技術措施對于中輕度Cd污染農田的安全利用具有重要意義。

蘋果酸（Malic acid，MA）是三羧酸循環（Tricarboxylic acid cycle，簡稱TCA循環）及其支路乙醛酸循環代謝過程中的重要中間產物[8]，可以迅速通過生物膜，進入線粒體內直接參與能量代謝，對于NADH的轉移和ATP的合成發揮著重要的作用[9]。為了保證細胞各種代謝活動對蘋果酸的需求，水稻和十字花科植物體內進化出多種蘋果酸酶（NADP?ME）基因家族[10?12]。當植物受到重金屬、干旱、鹽堿、高溫等非生物脅迫時，NADP?ME基因的表達水平和細胞中的蘋果酸積累量會顯著增加[10?11，13]。外源添加蘋果酸能顯著提高植物生長量，增加凈光合速率，減少H2O2的積累，增強根系活性，抑制根系對Cd的吸收和轉運等，進而減輕Cd的毒害作用[14?18]。水稻開花期葉面噴施蘋果酸，對水稻籽粒、穗軸、穗頸和旗葉中的Cd含量能產生顯著的抑制作用，對Mn、Zn等營養元素的轉運也有顯著的影響[19]。這些研究結果表明，蘋果酸能通過調控營養元素平衡、消除氧化損傷等多種方式緩解Cd對水稻產生的生理毒害作用。

植物抗逆指標有多種，抗氧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性氨基酸、氨基酸含量都和酶的活性有關，Cd脅迫和其他非生物脅迫都會引起抗氧化酶活性的變化。在Cd等重金屬脅迫環境中，水稻細胞經常通過合成大量的金屬硫蛋白、谷胱甘肽（GSH）、植物螯合素（PCs）來緩解Cd的毒害[20]。氨基酸是蛋白質的基本成分，對維持細胞的正常代謝非常重要。水稻籽粒中的蛋白質和氨基酸主要分布在胚和糊粉層中[21]，能與Cd形成螯合物使其失去生物毒性。谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和蘇氨酸5種氨基酸與水稻籽粒中Cd含量高度線性相關；谷氨酸的合成能力越強，籽粒中富集Cd的能力越強[22]。增施鈣鎂磷肥既能抑制Cd向稻米中的轉運，又能促進稻米中氨基酸的合成[23]。這些結果說明，氨基酸代謝與稻米的Cd積累特性密切相關。因此，本研究以氨基酸含量為主要指標，來研究氨基酸代謝與稻米Cd積累特性及蘋果酸降Cd效應的關系。

蘋果酸是植物根系和葉片中最豐富的小分子酸，并受植物種類、生長條件等多種因素的影響[9，24?26]。葉面噴施蘋果酸，除了能夠抑制稻米中Cd含量外，對稻米的氨基酸含量是否會產生影響，其降Cd效果在水稻品種間是否能夠保持穩定，尚未見相關研究報道。本研究以4個水稻品種為材料，采用水稻開花期葉面噴施蘋果酸的方法，對成熟期水稻各器官的Cd積累特性和籽粒中的氨基酸含量進行分析，對蘋果酸的降Cd效果和機理進行了探討，旨在為降Cd葉面調理劑的篩選和研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗供試土壤為天津市重金屬污染農田0～20 cm的表層土，于2019年5—10月在農業農村部環境保護科研監測所日光溫室中進行，土壤基本理化性質見表1。外源噴施的蘋果酸（C4H6O5）為分析純化學試劑。

1.2 供試水稻品種

根據多年的田間試驗和室內試驗，篩選出了4個Cd積累特性不同的品種，其中兩個是湖南省大面積推廣的秈稻品種“T優705”（705）和“湘早秈24號”（X24）[27?28]；另外兩個是從國家水稻核心資源庫提供的核心種質中篩選出的品種“鐵桿烏”（TGW）和“輻品36”（F36）[29]。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 The basic physicochemical properties of soil

1.3 樣品的處理與采集

選取飽滿均一的水稻種子在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min進行消毒，用去離子水洗凈，置于培養皿中保持濕潤狀態，在28℃恒溫箱里發芽[28]，待胚芽露白后播種于育苗盤中，放在人工智能氣候室中，水稻苗長到兩葉一心后將育苗盤中的水換成3 L左右1/4 Hoagland營養液，長到四葉一心之后，選取長勢均一的幼苗，將根沖洗干凈移栽到事先準備好的盆中。水稻揚花期進行葉面噴施處理，處理1噴施去離子水（CK）；處理2噴施2次5 mmol·L?1蘋果酸（MA1）；處理3噴施3次5 mmol·L?1蘋果酸（MA2）；每次噴施間隔12 h，每盆噴施50 mL，每個處理重復6次。水稻成熟期收取水稻籽粒、穗頸、旗葉、穗節、莖稈等樣品進行前處理，用于測定Cd含量、必需元素含量、籽粒氨基酸含量等指標。人工氣候室（寧波市科技園區新江南儀器有限公司）條件：白天溫度28℃，濕度80%，光照16 h，光照強度400μmol·m?2·s?1；夜間溫度20℃，濕度70%，8 h黑暗。

1.4 Cd和礦質元素及籽粒氨基酸的測定方法

參照Liu等[30]的方法，對樣品進行清洗后，用5 mmol·L?1CaCl2浸泡根系15 min后用去離子水洗凈并烘干。稱取根系與地上部各0.20 g放于消煮管內，加入7 mL硝酸與1 mL雙氧水進行消解試驗，消解后采用ICP?MS測定樣品中Cd、Ca、Fe、Mn、Zn含量。參照Yuan等[22]的方法，稱取0.25 g籽粒，加入15 mL 6 mmol·L?1的HCl在110℃下水解22 h，用去離子水定容至50 mL，吸取1 mL于50℃水浴中氮氣干燥，最后用檸檬酸鹽緩沖溶液重新溶解。溶解后采用高效液相色譜系統（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）進行氨基酸含量分析。

1.5 數據統計及分析

采用Microsoft Excel進行相關數據的計算、統計與處理。Cd含量和必需元素含量用SPSS17.0進行二因子隨機設計方差分析；氨基酸含量用SPSS 17.0進行單因子隨機設計方差分析，新復極差法（Duncan）作多重比較（同一器官的品種和蘋果酸濃度為12個處理進行多重比較）、差異顯著性檢驗，并用Origin 8.6作圖。

轉移系數為相鄰器官間Cd含量的比值[31]：

轉移系數（TFa/b）=a器官Cd含量/b器官Cd含量

2 結果與分析

2.1 蘋果酸對稻米Cd積累特性及轉移系數的影響

Cd含量在不同品種之間以及水稻各器官間存在明顯的差異。穗節中的Cd含量最高，穗頸次之，籽粒和旗葉最低；穗節中的Cd含量是穗頸和旗葉Cd含量的2～10倍（圖1A、圖1B）。雖然4個品種的開花期和生育期非常接近，但705和X24的穗節、穗頸、莖稈中的Cd含量明顯高于F36和TGW，說明品種的遺傳背景對各器官Cd積累能力有顯著影響。

雖然各器官的Cd含量在品種間有明顯差異，但噴施蘋果酸后產生的降Cd效應更為顯著，為了消除基因型及環境對蘋果酸效應的影響，顯示蘋果酸濃度對Cd含量的影響，將4個品種進行了平均值的比較。結果顯示，籽粒、穗頸、旗葉、穗節中Cd含量的下降幅度隨著蘋果酸噴施次數的增加而加大。與CK相比，噴施2次和3次蘋果酸后，4個品種籽粒中的Cd平均含量從0.26 mg·kg?1分別下降到0.14 mg·kg?1和0.09 mg·kg?1（圖1C），降幅分別為46.15%和65.38%（圖1D）；穗頸中的Cd平均含量從0.51 mg·kg?1分別下降到0.31 mg·kg?1和0.18 mg·kg?1，降幅分別為39.22%和64.71%；穗節中的Cd平均含量從1.60 mg·kg?1分別下降到1.04 mg·kg?1和0.69 mg·kg?1，降幅分別為35.00%和56.88%；旗葉中的Cd平均含量從0.18 mg·kg?1分別下 降 到0.14 mg·kg?1和0.12 mg·kg?1，降 幅 分 別 為22.22%和33.33%。

葉面噴施蘋果酸不僅影響各器官中的Cd含量，也影響Cd在相鄰器官間的轉運效率。噴施蘋果酸顯著抑制了Cd從穗頸向籽粒、旗葉向穗節的轉移。與對照相比，蘋果酸處理下Cd的TF籽粒/穗頸分別下降了24.37%和23.16%，TF穗節/旗葉分 別 下 降 了8.99%和28.24%。

2.2 葉面噴施蘋果酸對水稻各器官營養元素含量的影響

Ca、Fe、Mn和Zn等營養元素的含量在水稻不同品種及不同器官間差異非常明顯。Ca和Mn含量在不同器官中的高低次序為：旗葉最高，穗節和穗頸次之，籽粒最低（圖2A、圖2C）；Fe含量的分布特征表現為旗葉最高，籽粒和穗頸次之，穗節最低（圖2B）；Zn含量的分布特征表現為穗節最高，穗頸次之，籽粒和旗葉最低（圖2D）。營養元素在不同品種中分布也不同，X24和F36的Ca含量明顯高于705和TGW，TGW的Mn含量明顯低于其他3個品種，X24和705穗節中的Zn含量明顯高于F36和TGW。

噴施蘋果酸后，4個品種各器官中的Mn、Fe和Zn平均含量均顯著下降，但Ca的平均含量顯著上升（圖2E），噴施2次和3次蘋果酸使籽粒中的Ca含量分別增加16.02%和26.66%，Fe含量分別減少30.54%和43.14%，Mn含量分別減少23.07%和28.55%，Zn含量分別減少11.31%和19.57%；穗頸中的Ca含量分別增加19.60%和47.86%，Fe含量分別減少35.24%和47.52%，Mn含量分別減少12.85%和37.99%，Zn含量分別減少30.78%和50.28%；穗節中Ca含量分別增加8.67%和31.25%，Fe含量分別減少22.27%和41.57%，Mn含量分別減少15.78%和31.67%，Zn含量分別減少17.64%和37.34%，旗葉中Ca含量分別增加4.41%和36.26%，Fe含量分別減少57.37%和81.59%，Mn含量分別減少24.05%和29.13%，Zn含量分別減少18.09%和22.65%。

2.3 葉面噴施蘋果酸對水稻各器官營養元素轉移系數的影響

葉面噴施蘋果酸不僅影響各器官中必需營養元素的含量，也影響營養元素在相鄰器官間的轉運效率。蘋果酸能促進Ca從穗節向穗頸中轉移，而且各個品種之間也有差異，其中X24和F36的TF穗頸/穗節與CK差異達到顯著水平；蘋果酸也顯著促進了Fe從旗葉向穗節的轉移。與此同時，噴施蘋果酸抑制了Zn從穗節向穗頸的轉移，但促進了Zn從穗頸向籽粒中轉移，705中Zn的TF籽粒/穗頸顯著提高（表2）。

2.4 葉面噴施蘋果酸對水稻籽粒氨基酸含量的影響

稻米中的谷氨酸含量（18.37～24.34 mg·kg?1）顯著高于其他氨基酸，約是其他氨基酸的2倍以上（圖3A）。在Cd污染土壤中進行栽培時，705和TGW籽粒中的谷氨酸含量明顯低于X24和F36。亮氨酸、精氨酸、纈氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸、丙氨酸的含量在品種間的差異比較小，大多在3.49～8.52 mg·kg?1的范圍之內。異亮氨酸、酪氨酸和組氨酸的含量相對較低，但它們在F36中的含量顯著高于其他3個品種。噴施2次蘋果酸對稻米中的氨基酸含量沒有顯著影響，噴施3次蘋果酸顯著提高了甘氨酸和纈氨酸的含量，與CK相比，甘氨酸和纈氨酸的含量分別增加了46.45%和34.56%（圖3B）。噴施3次蘋果酸對谷氨酸、亮氨酸和胱氨酸的含量也有明顯的提高，但未達到5%的顯著水平。

3 討論

蘋果酸能通過呼吸作用對植物體內許多代謝過程產生調控作用。最近的研究表明，蘋果酸具有信號傳導功能，在提高植物抗逆能力方面發揮著重要作用[13，32?33]。雖然水稻葉片中含有大量的蘋果酸，但水稻開花期噴施5 mmol·L?1的蘋果酸，依然能夠對水稻灌漿過程中的Cd和營養元素的轉運產生顯著的影響[19]。近年來，葉面噴施肥料已經成為了水稻降Cd的重要措施。有研究表明，通過葉面噴施Zn和Mn等必需元素[34]，能夠提高水稻抗逆性，抑制Cd從根系向籽粒的轉運；噴施黃腐酸、胡敏酸鉀、有機硅等能夠降低籽粒中的Cd含量[35?36]。本研究結果顯示，葉面噴施蘋果酸也能夠降低稻米Cd含量，并且噴施兩次5 mmol·L?1蘋果酸的效果更好。

表2 蘋果酸對水稻器官間營養元素轉移系數的影響Table 2 Effects of malic acid on the transfer factors of nutrient elements between rice organs

水稻籽粒中的Cd含量受基因型和環境的共同影響，品種類型、生長季節、海拔高度、播種方式、灌水方式等都會顯著影響稻米中的Cd含量[7，30，37?38]。本研究選用的4個早稻品種Cd積累特性不同，在籽粒和穗頸中Cd含量由多到少依次為：705＞X24＞TGW＞F36。對照處理下，稻米中的Cd含量（0.22～0.29 mg·kg?1）均大于《食品安全國家標準 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）規定的大米Cd含量上限0.2 mg·kg?1，各器官中的Cd含量也有明顯的差異，其中穗節中的Cd含量最高，品種間的差異也最大，變幅為0.55～2.67 mg·kg?1。經過穗頸和穗軸的攔截，籽粒中的Cd含量在品種間的差異明顯變小，噴施蘋果酸后，4個品種籽粒中的Cd含量均下降至0.2 mg·kg?1以下，且降Cd幅度分別達到了46.15%和65.38%；與此同時，穗節中的Cd含量以及Cd在器官間的轉移系數TF穗節/旗葉和TF籽粒/穗頸也大幅度下降。這可能是葉面噴施的蘋果酸一部分與葉片中的Cd形成了MA?Cd螯合物，阻止了灌漿過程中葉片中的Cd向穗節的轉運；另一部分可能轉運到穗節和穗頸中，在這些器官中與Cd形成MA?Cd螯合物，抑制了Cd從穗頸向籽粒的轉運，致使稻米中Cd的含量大幅度下降[39?40]。由此可見，噴施蘋果酸能夠有效抑制水稻灌漿期間Cd從旗葉向稻米中的轉運，使Cd污染農田中的稻米Cd超標風險顯著下降，從而實現污染農田安全利用的目標；但在營養生長階段噴施蘋果酸，是否能夠抑制污染土壤中的Cd進入根系及其向營養器官轉運，尚需進一步的研究。

非選擇性陽離子通道（NSCCs）是一種普遍存在于生物膜上的離子通道，它們能夠直接參與植物體內的許多生理過程，如攝取營養、維持壓力、傳導信號等[41?42]。水稻體內的NSCCs能優先轉運必需元素，提高必需元素Ca、Mn、Zn的含量或者抑制NSCCs的活性，都能有效削弱Cd對NSCCs的競爭性結合，顯著抑制水稻植株對Cd的吸收和轉運[35，43?44]。離子通道的開放與關閉狀態常受許多因素的影響，一般將離子通道分為電壓門控型、配體門控型和機械門控型三大類[45?46]，但電壓、配體和機械刺激間有復雜的交互作用[47]。本研究發現，葉面噴施蘋果酸，能同時降低水稻籽粒、穗頸和穗節中的Cd含量以及Fe、Mn、Zn的含量，卻顯著提高了這些器官中的Ca含量（圖2E）。說明蘋果酸對離子通道的開放程度和選擇透性產生了調控作用，使得Zn、Fe、Mn和Cd的轉運受到抑制，導致它們在各器官中的含量下降；或者是蘋果酸對鋅鐵蛋白（ZIP）的離子轉運功能產生了抑制作用[44，48]，致使穗節等器官中的Zn、Fe和Cd同步下降（圖2B、圖2D）。蘋果酸在降低Cd、Fe、Mn和Zn離子轉運速率的同時，也提高了Ca2+從稻穗各部位向籽粒中的轉運。大量的研究證明，Ca2+是生物體內最重要的信號因子之一[41]，Ca2+在動物、植物和微生物抵制不良環境過程中發揮了重要的作用[49?51]。有些離子通道對重金屬的敏感性既與離子通道的氨基酸殘基構成有關，也與細胞中的Ca濃度有關[52?53]。蘋果酸有可能通過增加水稻穗部器官中Ca2+的濃度提高離子通道對有害重金屬Cd的識別和攔截能力。

氨基酸是合成蛋白質最重要的前體物質和組分[54]，與酶活性、基因表達和離子轉運的調控有關，在提高植物抗逆能力方面發揮著關鍵作用[55]。Cd污染不僅會降低水稻各個器官必需元素的含量，而且會導致籽粒中氨基酸含量的下降[22]。本研究發現，稻米中的谷氨酸含量遠高于其他氨基酸，在品種間有顯著的差異，葉面噴施3次蘋果酸能夠顯著提高甘氨酸和纈氨酸的含量，對谷氨酸、亮氨酸和胱氨酸的合成也有明顯的促進作用。這可能是因為葉面噴施蘋果酸后，稻米的Cd含量大幅度下降，Cd對氨基酸合成的抑制效應被消除；也可能是蘋果酸通過促進TCA循環，提高α?酮戊二酸向谷氨酸的轉化效率，進而促進了其他氨基酸的合成[56?57]。

4 結論

（1）水稻開花期噴施2～3次蘋果酸能顯著降低成熟期籽粒、穗頸、旗葉和穗節中的Cd含量，對4個水稻品種全部有效。噴施蘋果酸后經過穗頸和穗軸的攔截，4個品種籽粒中的平均Cd含量從0.26 mg·kg?1分別下降到0.14 mg·kg?1和0.09 mg·kg?1，降幅分別為46.15%和65.38%。

（2）葉面噴施蘋果酸對水稻各器官中Ca、Fe、Mn、Zn的含量及其在相鄰器官間的轉移系數產生了顯著影響。噴施蘋果酸后，各器官中的Mn、Fe和Zn含量均顯著下降，Ca的含量顯著上升。

（3）噴施3次蘋果酸后，稻米中的甘氨酸和纈氨酸含量分別增加了46.45%和34.56%；對谷氨酸、亮氨酸和胱氨酸的合成也有明顯的促進作用。