腫瘤相關成纖維細胞與上皮性卵巢癌順鉑耐藥性的研究

江 玉，孫 磊，張 英，陳 潁，張曉慧，顏士杰，肖 蘭

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖系統常見高度惡性腫瘤之一，病死率位居各婦科腫瘤首位，全球每年有超過14萬的卵巢癌相關死亡病例。化療耐藥是卵巢癌高致死率的重要因素之一，目前發生機制尚不十分明確。腫瘤微環境理論認為，腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）和細胞外基質是腫瘤對化療反應的重要決定因素。腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）作為 TME中重要基質細胞，分泌可溶性因子如促血管生成因子、基質金屬蛋白酶、細胞因子等，促進腫瘤生長、血管生成、浸潤和轉移，并增加腫瘤耐藥性。研究已證實CAFs參與調節多種惡性腫瘤耐藥，而CAFs在EOC化療耐藥中作用及其機制目前仍不明確。該研究在成功分離培養原代人 CAFs、正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs）的基礎上，將CAFs與EOC細胞系SKOV3細胞建立間接共培養體系，觀察CAFs在EOC細胞順鉑耐藥中的作用，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與標本 DMEM培養基、PBS購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自德國GIBGO公司；TRIzol試劑購自美國InvitroGen公司；逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自 TaKaRa公司；CCK8試劑盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；α-SMA與FAP抗體分別購自英國abcam及美國CST公司；YAP、CTGF、Cyr61抗體分別購自美國CST公司、英國abcam公司。選取2019年7—12月在安徽醫科大學第一附屬醫院進行手術切除的10例EOC患者的新鮮卵巢癌腫瘤組織標本，患者年齡40～60歲，術前未行放化療及免疫治療，術中臨床分期Ⅱ～Ⅳ期，術后病理診斷為EOC；對應收集同期40～60歲因良性疾病（子宮肌瘤）行全子宮雙附件切除患者新鮮上皮性卵巢組織標本。

1.2 方法

1.2.1 CAFs、NFs的分離純化與傳代培養 含雙抗冰PBS清洗2次，去除脂肪及出血壞死組織，剪至1 mm×1 mm×1 mm組織塊，加入與組織塊體積比1∶1的Ⅳ型膠原酶（1 mg／ml），37℃、5% CO培養箱中消化2～3 h，加入含血清培養基終止消化，1 000 r／min，離心5 min，棄上清液去除膠原酶，加入1～2 ml含20%胎牛血清、1%雙抗、0.01%生長因子的DMEM，接種于培養瓶中。于37℃、5% CO培養箱孵育培養。3～4 d左右成纖維細胞貼壁，7 d左右去除組織，瓶底細胞長滿后，以含20%胎牛血清、1%雙抗、0.01%生長因子的DMEM進行常規傳代培養，酶消化時間差法進行純化，取第3～9代成纖維細胞進行實驗。

1.2.2 免疫熒光實驗鑒定卵巢癌CAFs 取對數生長期的 CAFs、NFs，接種于共聚焦皿中，培養48 h后，吸棄培養基，PBS浸洗3次，每次5min，加入4%多聚甲醛固定20～30 min，固定完畢后PBS浸洗3次，每次5 min，0.3%Triton×100溶液穿膜15 min，PBS浸洗3次，每次5 min，1%BSA封閉30 min。吸棄BSA分別加入一抗 α-SMA（1∶100）和 FAP（1∶100）4℃孵育過夜，室溫復溫1 h后PBS浸洗3次，每次 5 min，滴加熒光二抗 Alexa Fluor 488（1∶200）錫紙包裹室溫孵育1 h，PBS浸洗3次，每次5min，滴加DAPI染色液避光孵育10min，PBS浸洗3次，每次5 min，滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片后立即于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 間接共培養體系的建立 CAFs、NFs長至70%～80%融合時，PBS漂洗2次，更換無血清培養基DMEM，繼續培養24 h后收集細胞培養液，1 000 r／min離心5 min后留取上清液即為卵巢CAFs、NFs的條件培養基，分裝后-20℃保存備用。選取對數生長期的卵巢癌SKOV3細胞以3×10／m l的濃度接種于6孔板中，24 h后換液，每孔中加入2 ml含10%胎牛血清的條件培養基繼續培養24 h，取共培養后細胞進行后續實驗。

1.2.4 實驗分組 CAFs與卵巢癌細胞共培養組（CAFs組）：含10%胎牛血清的CAFs條件培養基2 ml在37℃、5% CO培養箱中培養24 h；NFs與卵巢癌細胞共培養組（NFs組）：含10%胎牛血清的NFs條件培養基2 ml在37℃、5% CO培養箱中培養24 h；SKOV3細胞單獨培養組（SKOV3組）：含10%胎牛血清DMEM培養基2 ml在37℃、5% CO培養箱中培養24 h。

1.2.5 CCK8法檢測細胞增殖和細胞對順鉑半數抑制濃度 （half inhibitory concentration，IC）0.25%胰蛋白酶消化細胞，以1×10個／孔細胞密度接種到96孔板中，待細胞貼壁后，分別培養12、24、48、72 h，每孔加入10μl CCK-8并孵育1 h，酶標儀測量450 nm波長下OD值，每個樣本做5個復孔，根據 OD值繪制0、24、48、72 h增殖曲線；種板后培養24 h，分別加入終濃度為 0、50、100、150和 200 μmol／L含順鉑完全培養基，每組設5個復孔，37℃，5% CO條件細胞培養箱中作用48 h，每孔加入10μl的CCK8試劑，繼續培養2 h后，酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度OD值。重復3次，取平均值。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組細胞接種于6孔板中，待細胞匯聚度達到100%后，用滅菌槍頭在單層細胞層上用力劃線，劃痕后0、48 h分別在顯微鏡下觀察細胞劃痕的恢復情況并拍照。用圖像分析軟件分析細胞劃痕寬度并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率＝（劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h）／劃痕寬度0 h×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.7 DCFH-DA法檢測ROS水平 取對數生長期的SKOV3接種于共聚焦皿，細胞貼壁后換液建立間接共培養體系，培養24 h后吸棄培養液，加入1 ml無血清培養基稀釋好的10μmol／L DCFH-DA，37℃、5% CO培養箱內孵育20 min，無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 qPCR檢測YAP、CTGF和Cyr61 mRNA表達Trizol法提取各組細胞總RNA，經濃度、純度測定符合要求后，用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄cDNA，根據說明書進行SYBR GREEN熒光實時定量qPCR檢測YAP、CTGF、Cyr61。設3個復孔，所有反應進行 3次，2法計算 YAP、CTGF、Cyr61基因的相對表達量，各基因引物見表1。

表1 YAP、CTGF和Cyr61 mRNA引物序列

1.2.9 Western blot檢測細胞YAP、CTGF和Cyr61蛋白表達 取各組細胞，離心后收集；PBS溶液清洗2～3次，加入裂解液（RIPA∶PMF＝100∶1）置冰上充分裂解，以14 000 r／min離心15 min（4℃）；吸取上清液即為蛋白質提取物。采用BCA試劑盒測量蛋白質含量；取蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜上；室溫封閉2 h；5%BSA 4℃孵育一抗過夜，洗膜2～3次，每次10 min，二抗孵育1.5 h，洗膜。隨后取適量ECL顯影，化學發光檢測儀成像。分別依次使用 YAP（1∶1 000）、CTGF（1∶1 000）、Cyr61（1∶400）和 GAPDH（1∶1 000）抗體作為一抗，相應辣根過氧化物酶標記作為二抗（1∶10 000）。以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度比值計算各組蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 CAFs的鑒定 免疫熒光法測定CAFs高表達癌相關成纖維細胞激活標志物α-SMA和FAP，而NFs無明顯陽性α-SMA和FAP表達陽性（圖1）。證實原代分離培養細胞為人卵巢癌相關成纖維細胞（CAFs）和正常成纖維細胞（NFs），為后期研究提供可靠的細胞模型。

圖1 CAFs細胞中α-SMA和FAP蛋白陽性表達（×40）

2.2 CAFs對卵巢癌細胞增殖的影響 檢測各組細胞培養12、24、48、72 h后增殖情況，相對于 SKOV3組和NFs組細胞，CAFs組細胞增殖更快，在48 h時CAFs組SKOV3細胞增殖活性高于SKOV3組和NFs組，差異有統計學意義（F＝34.02，P＜0.001）；72 h時CAFs組SKOV3細胞增殖活性高于SKOV3組和NFs組，差異有統計學意義（F＝60.01，P＜0.001）（圖2）。提示CAFs可促進SKOV3細胞增殖。

圖2 各組共培養后SKOV3細胞增殖

2.3 CAFs對SKOV3細胞順鉑化療敏感性的影響不同濃度的順鉑作用48 h后，在相同濃度順鉑作用下，CAFs組SKOV3細胞存活率高于SKOV3組和NFs組，差異有統計學意義（F＝18.71，P＜0.05）（圖3）；CAFs組SKOV3細胞對 CDDP的IC較 SKOV3組或 NFs組升高，差異有統計學意義（F＝18.98，P＜0.01）（圖4）。上述結果提示，CAFs可降低SKOV3細胞對順鉑敏感性。

圖3 順鉑對各組共培養后SKOV3細胞增殖的影響

圖4 各組共培養后SKOV3細胞IC50

2.4 CAFs對卵巢癌細胞遷移能力的影響 劃痕愈合實驗檢測各組SKOV3細胞遷移能力。SKOV3組劃痕愈合率為（14.15±1.25）%，NFs組劃痕愈合率為（15.84±1.06）%，CAFs組劃痕愈合率為（52.15±1.26）%（圖 5），CAFs組與 SKOV3組和NFs組比較差異有統計學意義（F＝19.82，P＜0.01）。提示CAFs可促進SKOV3細胞遷移能力。

圖5 各組共培養后細胞遷移能力 ×10

2.5 共培養細胞的ROS含量 各組熒光染色情況如圖6所示，應用Image J軟件測得每組平均熒光強度（圖7）。CAFs組ROS平均熒光強度高于SKOV3組和NFs組，差異有統計學意義（F＝10.58，P＜0.01）。

圖6 各組共培養后SKOV3細胞ROS熒光染色 ×600

圖7 各組共培養后SKOV3細胞ROS平均熒光強度

2.6 CAFs-SKOV3細胞間接共培養體系 YAP、CTGF及Cyr61 m RNA水平表達 qPCR結果顯示：與SKOV3組和NFs組比較，CAFs組中YAP（F＝20.67，P＜0.01）、CTGF（F＝8.53，P＜0.05）及Cyr61（F＝21.74，P＜0.01）表達增加，差異有統計學意義（圖8）。

圖8 各組共培養SKOV3細胞YAP、CTGF、Cyr61 mRNA相對表達量

2.7 CAFs-SKOV3細胞間接共培養體系 YAP、CTGF及Cyr61蛋白表達 Western blot結果顯示：與SKOV3組和 NFs組比較，CAFs組中 YAP（F＝20.67，P＜0.01）、CTGF（F＝8.53，P＜0.05）及Cyr61（F＝21.74，P＜0.01）表達增加，差異有統計學意義（圖9）。

圖9 各組共培養SKOV3細胞YAP、CTGF、Cyr61蛋白表達

3 討論

腫瘤細胞并非孤立存在，上皮性卵巢癌細胞再生及獲得性耐藥的發生離不開TME中各組分的相互作用和相互促進。TME由腫瘤細胞及腫瘤間質構成，CAFs是腫瘤間質內主要成分，研究證實，CAFs與順鉑治療后癌細胞相互作用可促進肺腺癌細胞再生；CAFs還參與大腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤藥物耐藥過程。目前，關于CAFs在卵巢癌順鉑耐藥中的作用報道不多。本研究在成功分離培養人原代CAFs、NFs的基礎上建立CAFs與卵巢癌細胞間接共培養體系，體外效應實驗證實CAFs可促進卵巢癌SKOV3細胞的增殖（P＜0.001）及遷移（P＜0.01），降低SKOV3細胞對順鉑的敏感性（P＜0.01）。

ROS是影響細胞凋亡和增殖的關鍵因素，有報道提出，衰老過程中ROS積累，可導致免疫衰老和自噬缺陷，進而轉化成細胞免疫逃逸形成腫瘤。而腫瘤細胞產生的ROS作用于間質細胞，誘導間質產生高能代謝產物，為腫瘤細胞生存提供能量。為進一步明確CAFs促進卵巢癌細胞增殖、遷移能力及降低卵巢癌細胞對順鉑敏感性的作用機制，本實驗探討了各組卵巢癌SKOV3細胞ROS含量的變化，結果顯示與CAFs共培養卵巢癌SKOV3細胞中ROS含量較SKOV3組和NFs組升高，差異有統計學意義（P＜0.01），說明CAFs誘導SKOV3細胞自噬產生。

YAP是Hippo信號通路的關鍵組分，與多種癌癥類型發展、進展以及臨床預后相關。亦有研究指出，YAP是介導腫瘤進展包括上皮間充質轉換（mesenchymal transition in epithelium，EMT）、遷移及侵襲的關鍵因素。EMT是一個動態可逆的生物學過程，特點是Vimentin和 N-cadherin的表達，以及E-cadherin的表達抑制。相關實驗研究表明，YAP異常激活可經TGF-β1／SMAD2通路誘導EMT，而抑制YAP表達可抑制EMT過程，阻礙癌細胞侵襲，且YAP／TEAD協同激活可調節卵巢癌細胞多能性和化療耐藥。YAP異常激活后與細胞核內TEAD結合，可引起下游基因如 CTGF、Cyr61異常表達。而 CTGF、Cyr61基因可促進卵巢腫瘤的形成及癌細胞的生長、增殖、轉移，與卵巢癌患者的預后密切相關。本實驗通過qPCR方法檢測共培養體系SKOV3細胞耐藥相關基因YAP、CTGF及Cyr61的表達情況，發現 CAFs共培養 SKOV3中 YAP（P＜0.01）、CTGF（P＜0.05）及 Cyr61（P＜0.01）表達均較SKOV3組和NFs組上調，提示卵巢癌中CAFs可能直接或間接激活YAP、CTGF及Cyr61，導致卵巢癌化療耐藥的發生。

綜上所述，CAFs可促進卵巢癌細胞增殖、遷移，使SKOV3細胞對順鉑的敏感性降低。其機制可能與CAFs共培養致細胞中ROS含量明顯增加，促進卵巢癌細胞自噬及細胞中耐藥相關基因YAP、CTGF及Cyr61表達升高有關，為卵巢癌化療耐藥治療提供了新靶點。