糞菌移植對哮喘幼鼠氣道炎癥的影響及其機制

吳 誠,張 娟,賈媛媛,李秋紅,孫 新

(空軍軍醫大學第一附屬醫院兒科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

支氣管哮喘是常見的呼吸系統疾病,全球約有3億哮喘患者,且有一定的病死率[1]。與成人相比,哮喘在兒童中發病率更高,已成為導致兒童生活質量降低的主要疾病因素[2]。據我國第三次城市兒童哮喘流行病學調查結果顯示,城市兒童哮喘患病率平均為3.02%,較10年前相比增加了52.8%,而且呈逐年增長的趨勢,可見兒童哮喘是目前衛生醫療領域亟待解決的難題[3]。兒童哮喘多起始于3歲前,并且年齡的增長會使哮喘治療失敗的風險增加。同時,與無喘息癥狀的兒童相比,哮喘患兒到成年期發展為慢性阻塞性肺疾病的風險顯著升高[4]。因此在兒童期對哮喘進行有效的早期識別和防治干預是十分重要的,尤其是嬰幼兒期[5]。但是,現階段治療方法取得的效果并不理想,副作用較明顯,并且兒童患者的依從性較差[6]。研究發現,哮喘的發生發展與機體微生態的關系十分密切,尤其是腸道微生態。相對于健康人群,哮喘患者的腸道菌群豐度和優勢菌群均有顯著的變化[7]。前期研究表明,益生菌能通過改善胃腸道微生態和調控調節性T細胞(Tregs)有效緩解哮喘癥狀[8]。近年來,作為重建腸道菌群的有效手段,糞菌移植已被用于難辨梭狀芽孢桿菌感染、腸道免疫缺陷、炎癥性腸病、腸道過敏、頑固性便秘和代謝病等多種疾病的探索性研究和臨床治療,并取得了較好的療效[9-12]。糞菌移植是指將健康宿主糞便中的有效菌群移植到患者胃腸道內,重建新的腸道菌群生態,以實現對腸道及腸道外疾病的治療方法[13]。然而目前針對糞菌移植在哮喘中的作用及機制研究卻鮮有報道。本研究通過建立哮喘幼鼠模型,觀察糞菌移植對過敏性哮喘氣道炎癥的影響,并探討其作用機制,以期為哮喘研究提供新的方向和防治策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2周孕齡的BALB/c小鼠,體質量55-59 g,購自空軍軍醫大學動物實驗中心,動物生產許可證號:SCXK(陜)2019-001。孕鼠隨機分為正常對照組,哮喘模型組和糞菌移植組,每組各2只。

1.2 主要試劑和儀器

卵清蛋白(ovalbumin,OVA,Grade V,美國Sigma公司);氫氧化鋁[Al(OH)3]粉末(天津天士力化學試劑公司);乙酰甲膽堿(acetyl-β-methylcholinechloride,Mch,美國Sigma公司);Ⅳ型膠原酶(德國biofroxx公司);流式細胞染色緩沖液(美國eBioscience公司);小鼠IL-4、IL-5、IL-13 ELISA試劑盒(美國Sabbiotech公司);空氣壓縮霧化器(大連歐姆龍有限公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);小鼠肺功能儀(加拿大SCIREQ公司);自動酶標檢測儀(美國Bio-Rad公司);流式細胞儀BD FACSCalibur(美國BD Biosciences)。

1.3 孕鼠飼養

BALB/c小鼠于孕2周時購入,置于動物房中適應性飼養至自然分娩,正常供給飲食飲水。孕鼠生仔后,正常對照組有13只新生鼠,模型有15只新生鼠,糞菌移植組有12只新生鼠。小鼠均飼養于動物實驗中心,恒定室溫(21-25 ℃),濕度50%-65%,光照12 h/d,小鼠自由進食進水,飼養過程遵循實驗動物中心動物保護和使用指南,實驗中遵循“3R原則”,并且所有操作均嚴格遵守《實驗動物管理與使用指南》。

1.4 建立哮喘模型

在模型組和糞菌移植組小鼠出生后的第0天、第7天和第14天采用含10 μg OVA和1 mg Al(OH)3的生理鹽水配成20 μl致敏液進行腹腔注射致敏,并于第21-28天用1%OVA霧化液霧化吸入激發,隔天1次,每次30 min。對照組采用不含OVA、僅含Al(OH)3的生理鹽水進行腹腔注射,并用生理鹽水霧化,其他條件不變,研究技術路線圖見圖1。

圖1 研究技術路線圖

1.5 糞菌移植

生后第21-28天每日08:00,取對照組幼鼠新鮮糞便,按比例(W/V=1 ∶5)溶于無菌生理鹽水中,攪勻制成混懸液。懸液經20 mm孔徑的尼龍過濾器過濾后,于4 ℃ 6 000g離心5 min,溶解在生理鹽水中制成400 mg/ml的菌液。于10:00給予糞菌移植組幼鼠150 μl菌液灌胃,正常對照組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃。

1.6 霧化刺激法測定氣道高反應性

小鼠在末次霧化激發24 h后,經2%戊巴比妥鈉溶液(0.045 ml/g)腹腔注射麻醉進行氣管插管,將其連接于小鼠肺功能儀上,依次霧化吸入濃度為0,1.5,3,6,12,25,50,100 mg/ml的乙酰甲膽堿(Mch),記錄小鼠氣道總阻力值(Rrs)。

1.7 光學顯微鏡下計數肺泡灌洗液中白細胞及分類細胞百分比

小鼠經麻醉后仰臥位固定,分離頸部組織暴露氣管,進行氣管插管并固定。用4 ℃預冷的無菌PBS溶液進行支氣管肺泡灌洗,每次注入0.6 ml,停留20 s后回抽(回抽率>80%),重復3次,記錄回收量。將收集的肺泡灌洗液(BALF)于4 ℃ 2 500 r/min離心5 min,離心后的上清保存于-80 ℃備用,沉淀則用1 ml無菌PBS溶液重懸,取100 μl重懸液涂片,進行瑞氏-吉姆薩染色,在光學顯微鏡下進行白細胞總數及分類計數,并計算各分類細胞百分比。

1.8 肺組織病理切片染色

支氣管肺泡灌洗完畢后,解剖暴露小鼠肺部,取小鼠左肺下葉,并浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定,經酒精脫水、石蠟包埋后切片,進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學顯微鏡下觀察肺組織結構和炎癥細胞浸潤。

1.9 ELISA法檢測BALF中的炎性細胞因子

根據ELISA試劑盒操作說明對BALF上清中的IL-4、IL-5和IL-13細胞因子進行檢測,并在450 nm處使用酶標儀測定OD值,計算轉換為相應濃度。

1.10 流式檢測Tregs比例

無菌操作打開胸腔,取出肺臟并用眼科剪剪碎后,加入1 ml含10%胎牛血清的1640培養基和Ⅳ型膠原酶(1 mg/ml,3 ml/只),于37 ℃恒溫搖床內150 r/min消化1 h。用70 μm的濾網過濾后,4 ℃ 1 500 r/min離心15 min,收集肺組織細胞團,加入1 ml紅細胞裂解液反應5 min。再次離心10 min,用PBS清洗兩遍并重懸,調整細胞濃度為(2-4)×107/ml,每管100 μl,制成肺組織單細胞懸液。加入CD4-FITC(美國eBioscience公司)、CD25-APC(美國eBioscience公司),冰上避光孵育15-20 min,用流式液清洗2次,350g離心5 min,留沉淀。在每管中加入1 ml固定破膜液反應30-60 min后,再加入2 ml破膜工作液清洗2次,離心后留沉淀。100 μl破膜工作液重懸細胞,加入Foxp3-PE(美國eBioscience公司)室溫避光孵育30 min。流式液清洗2次,再次離心取沉淀,用流式液重懸細胞至200 μl,上機檢測。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 幼鼠行為學觀察

在造模霧化過程中,模型組小鼠出現明顯的焦躁不安、情緒激動、全身瘙癢、抓臉擦鼻、呼吸加快、打噴嚏、毛發豎起、腹肌抽搐等哮喘速發相表現,而對照組及糞菌移植組小鼠活動正常,無上述異常表現。

2.2 氣道高反應性

小鼠氣道阻力隨著吸入Mch濃度的增加而逐漸增高。與對照組相比,模型組小鼠在25,50,100 mg/ml Mch時氣道阻力顯著升高(P<0.000 1);與模型組相比,糞菌移植組在25,50,100 mg/ml Mch時氣道阻力顯著降低(P<0.05-0.000 1,見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.000 1

2.3 肺組織病理染色

蘇木精-伊紅(HE)染色法可觀察到炎性細胞的浸潤。通過三組小鼠肺組織染色結果的對比發現,對照組小鼠肺組織結構相對完整,氣道周圍無明顯炎癥細胞浸潤;模型組小鼠肺組織結構受損,肺泡壁斷裂,細小支氣管周圍有明顯的炎性細胞浸潤;糞菌移植組小鼠肺部炎癥反應相對較輕,肺部炎癥細胞浸潤也明顯較少(見圖3)。

圖3 小鼠肺組織HE染色(HE染色,×200)

2.4 BALF中白細胞總數及分類細胞百分比

與對照組相比,模型組小鼠BALF中白細胞總數明顯增多(P<0.001),主要表現為嗜酸粒細胞(P<0.000 1)和中性粒細胞(P<0.01)增多,淋巴細胞(P<0.001)和巨噬細胞(P<0.05)降低;與模型組小鼠相比,糞菌移植組小鼠BALF中白細胞總數顯著降低,其中嗜酸粒細胞和中性粒細胞顯著減少(P<0.001),淋巴細胞(P<0.001)和巨噬細胞(P<0.05)明顯升高(BALF中白細胞總數和分類細胞百分比分別見圖4,5)。

與對照組相比,***P<0.001;與模型組相比,###P<0.001

2.5 BALF中細胞因子水平變化

與對照組相比,模型組小鼠BALF中炎性細胞因子IL-4(P<0.000 1)、IL-5(P<0.01)和IL-13(P<0.05)水平顯著升高;與模型組相比,糞菌移植組BALF中IL-4(P<0.000 1)、IL-5(P<0.01)和IL-13(P<0.01)水平顯著降低(見圖6)。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,##P<0.01,###P<0.001

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.000 1

2.6 小鼠肺組織中Tregs比例變化

與對照組相比,模型組小鼠肺組織中的Tregs在CD4+T細胞中的比例明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糞菌移植組小鼠肺組織中Tregs在CD4+T細胞中的比例顯著升高(P<0.05,見圖7,8)。

圖7 小鼠肺組織中Tregs的流式圖

與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,以氣道高反應性、可逆性的氣流受限和多種炎癥細胞浸潤為主要特征。目前,哮喘僅能經藥物治療以控制癥狀,尚不能被完全治愈,且發病機制仍未被完全闡明。因此,對兒童期哮喘的發病機制和治療新靶點新途徑的深入研究具有重大的現實意義。研究表明,過敏性哮喘患者呼吸道炎癥的病理改變以嗜酸粒細胞的浸潤、2型輔助性T細胞(Th2細胞)的活化和血清免疫球蛋白(IgE)的升高為主[14]。Th1/Th2細胞失衡被普遍認為是哮喘的免疫學發病基礎,表現為Th2細胞功能亢進和Th1細胞功能降低,而炎性細胞因子IL-4、IL-5和IL-13則主要是由Th2細胞所分泌[15,16]。哮喘的發病因素十分多樣,其中環境因素也發揮重要作用,而腸道微生物觸發因子作為一個重要的環境因子,在哮喘的發生發展中起著重要作用[17]。而糞菌移植即是通過將健康供體的微生物群轉移到一個紊亂的微生物生態系統中,調控胃腸道微生物群以恢復穩態,是一種相對直接的干預治療方法[18]。糞菌移植作為近年來新興的治療方式,在各類菌群相關性疾病的科學研究和臨床應用中起到一定的治療作用。有文章從不同角度對糞菌移植在哮喘的控制和治療方面的理論可行性進行了闡釋,但罕有報道將其付諸具體研究[19]。本研究結果顯示,相比于模型組,糞菌移植可以減輕哮喘幼鼠肺部的炎性細胞浸潤,降低氣道高反應性,減少BALF中白細胞總數、嗜酸粒細胞和中性粒細胞,并且BALF中的炎性因子IL-4、IL-5和IL-13水平也明顯下降,提示糞菌移植能夠有效抑制哮喘幼鼠的Th2型免疫反應,具有較好的治療作用。

Tregs是一類主要發揮抑制性免疫調節功能的T淋巴細胞亞群,在維持免疫耐受、限制慢性炎癥、調節淋巴細胞穩態的過程中發揮重要作用[20-22]。Tregs可通過表達膜結合性或可溶性抑制分子,或分泌抑制性細胞因子(如IL-10、IL-35和TGF-β),對過敏性炎癥起到抑制作用[23]。腸道微生物可通過菌群自身或者其代謝產物影響Tregs的數量和功能,進而促進抑制性細胞因子的分泌以調控體內免疫狀態,這種作用在對哮喘的保護中同樣出現[24]。本研究結果表明,糞菌移植干預能有效增加肺組織中Tregs在CD4+T細胞中的比例,提示糞菌移植可通過誘導肺組織Tregs的產生,促進Tregs表達抗炎因子,抑制效應性T細胞的增殖和Th2型細胞因子的大量分泌,進而減輕肺部和氣道的過敏性炎癥。

綜上所述,通過給予糞菌移植干預,哮喘幼鼠的氣道過敏性炎癥明顯減輕,BALF中的炎癥細胞數量和Th2型細胞因子表達顯著減少,同時糞菌移植能夠誘導肺組織中Tregs的產生,促進免疫負調控功能的表達并發揮抗炎作用,對過敏性哮喘具有一定的治療效果,為哮喘的治療提供新的思路和方法。