補腎解毒方抗核輻射損傷作用機制研究

楊云霜，趙 雪，杜 磊，李延暉，石鵬展 ，SABUR Sanzhar(哈薩克斯坦)，張 蓉

(1.北京市隆福醫(yī)院治未病科，北京 100010；2.火箭軍特色醫(yī)學中心，北京 100088；3.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029)

輻射極易造成免疫系統(tǒng)的損害，抑制保護性免疫因子的生成以及釋放大量內源性危害因子，這些免疫系統(tǒng)的改變均能造成機體免疫功能障礙并伴隨組織損傷，故輻射損傷中免疫系統(tǒng)防護為當今亟待解決的輻射防護問題之一。Ito等[1]對1945年廣島原子彈爆炸暴露人群追蹤調查發(fā)現(xiàn)此類人群均有不同程度胸腺萎縮。同時有研究顯示輻射可引起血液、脾臟、淋巴中免疫細胞數目減少[2]。這與本研究小組前期對胸腺、脾臟指數觀察所得結果一致[3]。文獻表明輻射主要通過TLR4信號通路介導相關炎癥反應，故此通路相關受體與蛋白的表達在機體遭受輻射后常存在不同程度的改變[4]，但對此通路上下游相關因子與輻射相關性的系統(tǒng)闡述尚未可知。本研究中補腎解毒方為滋陰補腎、清熱解毒之方，有扶正祛邪之效，通過長期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)其能夠調節(jié)輻射后炎性細胞因子的表達[5-6]，本研究通過測定輻射后第1、14、30 天TLR4通路上下游因子水平的變化，以探索補腎解毒方抗輻射后免疫損傷防護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究動物：SPF級健康雄性小鼠276只，平均體重(20±2) g，由南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院提供，實驗動物合格證號SCXK(蘇)2010-0001。其中138只為直接從南京大學南京生物醫(yī)藥研究院購買C57BL/10SCNJ(TLR4-/-)基因敲除小鼠，另外138只小鼠為南京大學模式動物研究所從美國JAX公司代購的C57BL/10SCNJ(TLR4+/+)小鼠繁育的子代。小鼠自由攝食飲水，進食普通顆粒飼料，北京師范大學生命科學院實驗動物中心動物房飼養(yǎng)，動物房保持恒溫，22 ℃，濕度60%～90%。

1.1.2 主要試劑與儀器：小鼠TOLL樣受體4酶聯(lián)免疫試劑盒(RGB & CHN公司，Lot:20150109、60293M)，CD14/Treg細胞流式試劑盒(BD PMG公司)。電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，型號：00000246)、60Coγ射線輻射裝置(北京師范大學化學學院)、高速臺式冷凍離心機(上海天美科學儀器有限公司，型號：CT15RT)、Thermo 全自動酶標儀(芬蘭Thermo Scientific公司，型號：Multiskan MK3)、流式細胞儀(德國 BD Calibur公司，型號：雙激光四色)、流式細胞分析軟件(德國 BD Calibur公司，版本：CellQuest Pro)。

1.2 實驗方法

1.2.1 補腎解毒方：由熟地、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉、白花蛇舌草各10 g，山茱萸12 g，冬蟲夏草3 g組成本方。

1.2.2 建模分組及給藥：采用隨機數字表法將138只TLR4+/+小鼠隨機分為TLR4+/+空白對照組18只、TLR4+/+輻射模型組60只、TLR4+/+補腎解毒方組60只；138只TLR4-/-小鼠隨機分為TLR4-/-空白對照組18只、TLR4-/-輻射模型組60只、TLR4-/-補腎解毒方組60只。按人體給藥量換算成小鼠等效劑量作為小鼠給藥量，給藥劑量為13.5 g/(kg·d)[7]，將中藥顆粒加無菌水配至18 ml混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用，給藥劑量為0.2 ml/d。分組后每天上午8:00補腎解毒方組給予中藥灌胃，容積0.2 ml，空白對照組、輻射模型組給予生理鹽水灌胃，容積0.2 ml，連續(xù)灌胃10 d，第11 天，除空白對照組外，其他四組分別進行一次性6Gy60Co γ-射線照射，照射后第1 天開始繼續(xù)灌胃，連續(xù)30 d。

TLR4+/+空白對照組、TLR4-/-空白對照組分別于輻射后第1、14、30天各取材6只。其余四組分別于輻射后第1天取材7只；輻射后第14天取材每組存活小鼠數量的50%；輻射后第30天每組剩余存活小鼠全部取材。眼球采血后頸椎脫臼法處死；采血(1±0.2)ml，放入1.5 ml含有肝素抗凝劑的離心管中，置4 ℃，離心半徑8 cm離心機，3000 r/min，離心5 min，分離血清，置-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 ELISA檢測法：將標準品稀釋后加樣，置37 ℃溫育30 min，20 ml的30×PBS緩沖液、580 ml純水配制成600 ml、pH值為7.4的洗液，孵育完成后撤掉封板膜，棄液后甩干，加洗滌液靜置30 s后棄去，重復5次，加酶50 μl，再次溫育、洗滌，加顯色劑A、B顯色，37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μl，依序測量各孔吸光度，讀取數值。

1.2.4 流式細胞學法：加入抗體，分別加入CD14、CD4、CD25抗體各5 μl，加樣本100 μl，充分搖勻，室溫避光孵育20 min。取出試管，每管加溶血素2 ml，室溫避光放置10 min。待紅細胞全部溶解，1500 r/min，離心5 min，去上清。每管加入2 ml的PBS緩沖液洗細胞兩次，1500 r/min，離心5 min，去上清，每管加入0.5 ml的PBS，放4 ℃冰箱，4 h內上機檢測。

2 結 果

2.1 輻射后各組小鼠CD14的動態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射模型組小鼠CD14與空白對照組相比均有不同程度的降低(P<0.01)，且TLR4+/+補腎解毒方組與TLR4+/+輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TLR4-/-補腎解毒方的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。輻射后第14天，各輻射模型組CD14明顯升高，且均高于空白對照組水平(P<0.01)。TLR4+/+補腎解毒方組的CD14高于TLR4+/+輻射模型組，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。TLR4-/-補腎解毒方組的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。輻射后第30天，各輻射組CD14水平與第14天比較均有所下降，但TLR4+/+補腎解毒方組仍高于TLR4+/+輻射模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。TLR4-/-補腎解毒方組的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1(圖1)。

表1 各組小鼠輻射后CD14水平比較(%)

2.2 輻射后各組小鼠TLR4動態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射組TLR4無明顯變化；輻射后第14天及第30天TLR4+/+補腎解毒方組的TLR4均高于TLR4+/+輻射模型組，且輻射后第30天，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 輻射后各組小鼠MD2動態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射模型組MD2無明顯變化；輻射后第14天及第30天，TLR4+/+補腎解毒方組的MD2高于TLR4+/+輻射模型組；輻射后第1天TLR4-/-補腎解毒方組與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各時間點的MD2水平TLR4-/-補腎解毒方組、TLR4-/-輻射模型組與TLR4-/-空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表3。

2.4 輻射后各組小鼠CD4+CD25+Treg細胞動態(tài)變化 輻射后第1天，與空白對照組比較，TLR4-/-輻射模型組CD4+CD25+Treg細胞均低；其他三組均高于空白對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TLR4+/+補腎解毒方組低于TLR4+/+輻射模型組，輻射后第14天及第30天，各輻射模型組CD4+CD25+Treg細胞與空白對照組比較均升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TLR4+/+補腎解毒方組的CD4+CD25+Treg細胞高于TLR4+/+輻射模型組，TLR4-/-補腎解毒方組與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4(圖2)。

圖1 各組小鼠輻射后各時間點CD14動態(tài)變化

圖2 各組小鼠輻射后各時間點Treg細胞動態(tài)變化

表2 各組小鼠輻射后TLR4動態(tài)變化(ng/ml)

表3 各組小鼠輻射后MD2動態(tài)變化(ng/ml)

表4 各組小鼠輻射后Treg細胞動態(tài)變化(%)

3 討 論

中醫(yī)認為輻射是一種由外作用于人體，具有強烈致病作用的毒邪，來勢剽悍、易傷陰耗氣、損傷各臟腑功能、損傷正氣，進而導致人體抗病能力下降[8]。通過對氣血雙補方劑、扶正解毒方劑與滋補腎陰方劑的對比研究，發(fā)現(xiàn)應用滋補腎陰方劑可顯著緩解輻射對免疫器官(胸腺、脾臟)的影響[9]。滋補腎陰方劑不僅可填精益髓，增強機體抗病能力，亦可壯水之主，以制陽光，緩解由輻射火毒之邪導致的火毒熾盛的表現(xiàn)，如口燥咽干、血熱出血、瘡瘍腫毒等癥[10]。補腎解毒方是以六味地黃丸為基礎，減少熟地用量以防滋膩，另加冬蟲夏草、白花蛇舌草化裁而成，冬蟲夏草能抗氧化、抗炎、調節(jié)免疫功能，白花蛇舌草可以刺激網狀內皮系統(tǒng)，提高白細胞吞噬能力，增強機體抵抗力。諸藥合用，具有滋陰益腎、涼血解毒的功效，發(fā)揮保護機體、減輕輻射損傷的作用，并且中藥方劑安全性較高、防治結合，作為輻射防護藥物易被接受。

TLR4分布廣泛，其相關通路具有識別病原體及其產物、釋放炎性因子，進而介導炎癥反應的作用。TLR4是介導內毒素/脂多糖所誘導炎癥反應的重要受體，且與輻射損傷密切相關，通過激活TLR4通路可以有效產生輻射抵抗現(xiàn)象[11]。TLR4受體的結構分為胞外域、跨膜域、胞內域，其中胞外域為結合CD14與MD2的重復亮氨酸序列(Leucine richrepeat，LRR)，具有識別病原體的作用；胞內域的高度保守序列在TLR4與配體結合后，介導激活相關炎癥細胞因子基因的表達[12]，CD14、TLR4、MD2共同形成跨膜復合物，在介導內毒素引起的炎癥反應中起到重要作用。CD4+CD25+Treg細胞為TLR4信號通路中一種調節(jié)性T細胞，主要介導免疫耐受，抑制T細胞免疫功能，下調免疫應答[13]。本此研究旨在通過檢測外周血中CD14、TLR4、MD2、Treg細胞水平動態(tài)變化，探討輻射對免疫系統(tǒng)TLR4信號通路影響和制約，以及補腎解毒方抗輻射損傷是否通過本信號通路發(fā)揮作用。

CD14在胞外與TLR4受體結合，可識別病原體LPS，并將其固定于胞外，具有結合、富集、遞呈LPS給下游信號受體的作用[12]。CD14是TLR4上游啟動因子，本實驗結果顯示TLR4+/+小鼠輻射后CD14水平先降低后升高，說明CD14在輻射急性期受到抑制，而輻射后第14 天，補腎解毒方通過刺激CD14大量釋放從而激活TLR4信號通路，積極對輻射所致的免疫抑制做出調整與恢復，有研究顯示通過TLR4通路的激活，下游釋放出具有保護作用的炎性因子IL-6、IL-10等[14]。輻射后第30天，TLR4+/+補腎解毒方組的CD14下降更為明顯，接近空白對照組水平。TLR4-/-小鼠輻射組與補腎解毒方組CD14變化水平與趨勢基本一致，說明補腎解毒方對其并未產生保護作用，CD14水平的波動多由機體受到輻射刺激產生的無區(qū)別應激反應導致，由此可以推斷，補腎解毒方是通過TLR4信號通路發(fā)揮免疫防護作用。

TLR4受體水平輻射后波動較小，僅于輻射后第30天出現(xiàn)顯著升高，說明補腎解毒方對TLR4受體具有遠期防護作用。MD2存在于免疫細胞表面，與TLR4受體形成一種異質二聚體復合物，協(xié)同CD14共同介導炎癥反應，產生相應炎性因子[15-16]。本實驗中各組MD2水平區(qū)別不明顯。以上研究結果顯示TLR4+/+補腎解毒方組小鼠CD14、TLR4、MD2水平變化趨勢大致一致，均在輻射后第14 天上升，隨后逐漸下降，說明補腎解毒方通過激活TLR4通路，釋放保護性炎癥因子，包括IL-10、IL-12、TGF-β1等[5-6]，進而發(fā)揮免疫防護效應，楊麗梅等[17]認為IL-12具有抗輻射損傷效應；而TLR4-/-兩組小鼠因體內缺乏TLR4受體，因此不能通過TLR4信號通路進行干預和調控，輻射后第14天及第30天 CD14、MD2表達水平明顯高于空白對照組，且兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。并且通過測定下游炎性因子[5]，發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠釋放的IL-17，IL-18，IFN-γ等損傷性炎性因子增加，而保護性炎癥因子IL-10，TGF-β1減少，故出現(xiàn)嚴重的免疫損傷及較高的病死率。

CD4+CD25+Treg細胞作為一種能夠抑制免疫功能的T細胞亞群，當機體受到輻射時，能夠維持機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，提高機體的自身修護能力，以減輕機體炎癥反應，降低輻射后損傷發(fā)生[18-19]。本研究結果顯示，輻射模型組與TLR4+/+補腎解毒方組CD4+CD25+Treg細胞均出現(xiàn)不同程度增高，但補腎解毒方組Treg細胞表達水平增加更加平穩(wěn)與長效。由此可見,補腎解毒方可通過TLR4信號通路促進輻射后機體內CD4+CD25+Treg細胞的分化、發(fā)育、成熟，發(fā)揮免疫抑制作用，防止機體受外界刺激后免疫機能亢進，從而保護機體免受輻射傷害。

所述，輻射所致機體免疫功能障礙通過作用于TLR4信號通路形成，而本研究團隊的補腎解毒方具有滋陰益腎、涼血解毒功效，可通過對此通路的調節(jié)起到減少損傷性炎癥因子釋放，增強機體正常免疫功能，從而減輕輻射所致免疫功能障礙，為涉核人員、接受放射療法癌癥患者預防性用藥及核接觸后防護性用藥。