VEGF-A和VEGF-C雙拮抗抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的實驗研究

黃崇青 黃景勇 裘益輝

血管瘤是常見的腫瘤，好發(fā)于頭面部[1]。大多數(shù)皮下血管瘤是良性的，但有些可能轉化后變成惡性[2]。目前，血管瘤的增生和消退演變機制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A（VEGF-A）的表達在血管瘤的形成過程中起重要作用[3]。VEGF家族由6個成員組成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）[4]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，血管瘤增生期VEGF-A和VEGF-C的表達水平明顯高于血管瘤消退期；采用轉染攜帶短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質粒的方法抑制 VEGF-A或VEGF-C表達，可以抑制血管瘤內(nèi)皮細胞（hemangioma endothelial cells，HemECs）的生長；但 VEGF-A 和VEGFC似乎通過不同的信號通路來調(diào)節(jié)HemSCs的增殖和凋亡[5]。筆者團隊在前期研究的基礎上，擬進一步探討同時抑制VEGF-A和VEGF-C表達對HemECs增殖的影響及可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HemECs（上海生命科學研究所）；原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（美國 ATCC公司）；CAG 啟動子（promoter of cytomegalovirus early enhancer element-chicken betaactin gene promoter-rabbit beta-globin gene acceptor，pCAG）-熒光素酶（luciferase，LUC）骨架（美國 Clontech公司）；人胚胎腎細胞 293T（human embryonic kidney 293T，HEK293T）（美國 ATCC 公司）；Lipofectamine-3000（美國Invitrogen公司）；MTT細胞增殖檢測試劑盒（美國 Roche公司）；溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）試劑盒（美國Millipore公司）；Western blot的初級抗體（美國Cell signaling公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的抗兔二抗（美國Jackson Immuno研究所）；外購的10周齡雄性裸鼠（上海實驗動物中心），在每個實驗條件下分析20只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 實驗模型建立和分組 將2×107個HemECs和1×107個 HUVEC 混合，沉淀，然后重懸于 200 μl基質膠（美國 Becton-Dickinson Biosciences公司）皮下注射到裸鼠的背部。通過生物發(fā)光測定IVIS成像系統(tǒng)（美國Xenogen公司）對腫瘤進行成像，4周后評估植入的腫瘤。在尾靜脈注射50 mg/kg體重的熒光素（美國Sigma-Aldrich公司）5 min后拍攝圖像，行腫瘤生物發(fā)光圖像采集（60 s后可得分析結果，行10次圖像分箱）。解剖裸鼠后測量植入腫瘤的重量。將實驗裸鼠分為4組：空白對照組（control組）、通過shRNA技術抑制VEGF-A表達的shVEGF-A組、抑制VEGF-C表達的shVEGF-C組以及同時抑制VEGF-A和VEGF-C表達的shVEGFA+C組。

1.2.2 具體實驗方案

1.2.2.1 質粒制作 （1）以前面獲得的在消退期和增生期血管瘤中發(fā)生明顯表達水平變化的VEGF家族成員為對象，設計shRNA。（2）HemECs進行細胞培養(yǎng)，用攜帶對照（control組）或shVEGF-A或shVEGF-C或組合的 shVEGF-A和 shVEGF-C（shVEGF-A+C）的質粒轉染后，采用RT-qPCR法檢測轉染細胞上VEGF-A和VEGF-C mRNA的表達。（3）以確定抑制效率的攜帶特異shRNA的質粒制作腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV），用以體內(nèi)實驗。使用pCAG-LUC骨架制備pCAG-shVEGF-A-LUC、pCAG-shVEGF-C-LUC 和pCAG-shVEGF-A+C-LUC，進行測序以驗證這些新制備的質粒的正確方向。使用HEK293T細胞用Lipofectamine-3000產(chǎn)生攜帶目標構建體的AAV。shVEGF-A的序列是5'-TGTGAATGCAGACCAAAGA-3'。shVEGFC的序列是5'-TGCAAGCATTATGTCAGCA-3'。對照的序列是5'-GGTATCTACTAGATGTACT-3'。

1.2.2.2 抑制相應VEGF蛋白對HemECs生長和增殖的影響觀察 （1）以設計的攜帶特異的shRNA的質粒轉染HemECs，并使用MTT法檢測細胞生長的變化。具體為使用MTT細胞增殖檢測試劑盒（美國Roche公司）檢測570 nm處的吸光度值。（2）以設計的攜帶特異shRNA的質粒轉染HemECs，并在細胞培養(yǎng)中加入BrdU，通過染色定量的方法檢測細胞增殖的變化。具體為將BrdU（美國 Sigma-Aldrich公司）加入到培養(yǎng)細胞中，終濃度為1 μg/ml；然后2 h后使用BrdU IHC試劑盒進行BrdU的免疫細胞化學染色，DNA用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國 Thermo Scientific公司）染色。（3）以設計的攜帶特異shRNA的質粒轉染HemECs，并提取細胞的蛋白，進行Western blot檢測與細胞周期相關的因子變化以確定VEGF家族蛋白的下游的細胞周期相關信號傳導通路。

1.2.2.3 抑制相應VEGF蛋白對HemECs凋亡的影響觀察 （1）以設計的攜帶特異的shRNA質粒轉染HemECs，并使用Annexin V方法，采用流式細胞分析技術測定細胞凋亡的變化。（2）以設計的攜帶特異shRNA的質粒轉染HemECs，并提取細胞的蛋白，進行Western blot檢測與細胞凋亡相關的因子變化以確定VEGF家族蛋白的下游的凋亡相關信號傳導通路。

1.2.2.4 抑制相應VEGF蛋白對體內(nèi)血管瘤生長的影響觀察 將抑制相應VEGF蛋白的HemECs種植于裸鼠皮下，采用熒光素測定法（瘤細胞攜帶熒光素酶）測定其對體內(nèi)血管瘤生長的影響，4周后解剖裸鼠后測量植入腫瘤的重量，觀察抑制相應蛋白對體內(nèi)血管瘤生長的影響。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.14 組HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表達水平比較 4組HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與control組相比，shVEGF-A組HemECs VEGF-A mRNA表達水平下降（P＜0.05），shVEGF-C組HemECs VEGF-C mRNA表達水平下降（P＜0.05），shVEGF-A+C組VEGFA和VEGF-C mRNA表達均水平下降（均P＜0.05），見圖1。

圖1 4組血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）和血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）mRNA表達水平比較（與 control組比較，*P＜0.05）

2.2 4組HemECs生長情況比較 與control組比較，shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs均生長受限（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGFC組HemECs生長受限更明顯（均P＜0.05），見圖2。

圖2 4組血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）生長情況比較（與control組比較，*P＜0.05；與 shVEGF-A+C 組比較，△P＜0.05）

2.3 4組HemECs增殖情況和細胞周期調(diào)節(jié)因子表達比較 與control組比較，shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs增殖均受抑制（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs增殖受抑制更明顯（均P＜0.05）。與control組比較，shVEGF-A組細胞周期抑制因子p21表達水平升高（P＜0.05），細胞周期激活因子CyclinD1和CDK4表達水平降低（均P＜0.05）；shVEGF-C組細胞周期抑制因子p27表達水平升高（P＜0.05），細胞周期激活因子CyclinB2表達水平降低（P＜0.05）；shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs細胞周期抑制因子p21、p27表達水平升高（均P＜0.05），細胞周期激活因子CyclinD1、CDK4表達水平降低（均P＜0.05）。見圖3（插頁）。

圖3 4組血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）增殖情況和細胞周期調(diào)節(jié)因子表達比較（a為HemECs BrdU檢測的代表性圖像，紅色為BrdU，藍色為DNA；b為BrdU細胞百分比比較；c為細胞周期調(diào)節(jié)因子Western blot蛋白質印跡；d為細胞周期調(diào)節(jié)因子蛋白表達水平比較；與control組比較，*P＜0.05；與 shVEGF-A+C 組比較，△P＜0.05）

2.4 4組HemECs凋亡情況和凋亡相關蛋白表達水平比較 與control組相比，shVEGF-A組、shVEGF-C組HemECs中凋亡細胞百分比升高（均P＜0.05），而shVEGFA+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs中的細胞凋亡百分比更高（均P＜0.05）。與control組相比，shVEGF-A組HemECs促凋亡蛋白CYTC和caspase3表達水平均升高（均P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低（P＜0.05）；shVEGF-C組促凋亡蛋白 caspase9表達水平升高（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低（P＜0.05）。shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組CYTC、caspase3和caspase9表達水平升高，Bcl-2表達水平降低。見圖4。

圖4 4組血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）凋亡情況和凋亡相關蛋白表達水平比較（a為流式細胞圖比較；b為凋亡細胞百分比比較；c為凋亡相關蛋白Western blot蛋白質印跡；d為凋亡相關蛋白表達水平比較；與control組比較，*P＜0.05；與shVEGF-Atc組比較，△P＜0.05）

2.5 4組HemECs移植到裸鼠體內(nèi)后腫瘤生長情況比較 與control組相比，shVEGF-A組和shVEGF-C組腫瘤均縮小，抑瘤率分別為25.35%、49.21%（均P＜0.05），而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGFC組腫瘤更?。ň鵓＜0.05），抑瘤率為73.43%。見圖5（插頁）。

圖5 4組血管瘤內(nèi)皮細胞（HemECs）移植到裸鼠體內(nèi)后腫瘤生長情況比較（a為腫瘤生物發(fā)光測定代表性圖像；b為腫瘤發(fā)光圖像定量比較；c為腫瘤大小整體視圖比較；d為相關腫瘤重量比較；與control組比較，*P＜0.05；與shVE-A+C組比較，*P＜0.05）

3 討論

VEGF家族由6種分泌氨基酸組成，其中VEGF-A可能在血管生成中起著最重要的作用[6]。然而，VEGF-A的確切作用可能需與其他成員相協(xié)調(diào)，因為VEGF成員和受體有一個復雜的配體-受體結合圖[7]。值得注意的是，VEGF-C只與血管內(nèi)皮生長因子受體（vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR）3 結合，通過 VEGFR3促進淋巴管生成，這與VEGF-A和VEGFR 2介導的血管生成不同[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，VEGF-A和VEGF-C的聯(lián)合抑制對HemECs的生長有更顯著的限制作用，因此血管新生和淋巴管生成都是導致血管瘤惡性生長的重要因素。

本研究結果發(fā)現(xiàn)VEGF-A或VEGF-C的抑制似乎通過不同的信號轉導途徑影響細胞增殖。例如，VEGF-A抑制細胞周期蛋白D1和CDK4表達，后者形成調(diào)控復合物來控制G1/S轉換[9]。VEGF-E抑制CyclinB2，CyclinB2主要控制G2/M轉變[10]。VEGF-A抑制不改變CyclinB2，VEGF-E抑制不改變CyclinD1和CDK4。此外，由于VEGF-A和VEGF-E的抑制作用分別增加了2個G1檢查點CDK抑制物p21和p27[11]，這些數(shù)據(jù)表明VEGF-A促進HemECs的增殖可能主要通過促進G1/S轉換，而VEGF-E可能通過促進G1/S轉換和G2/M轉換促進HemECs的增殖。因此可以理解，抑制VEGF-A和VEGF-E對HemECs有更顯著的抗增殖作用。

同樣，本研究結果顯示VEGF-A或VEGF-C的抑制作用可能通過不同的信號轉導途徑影響細胞凋亡。CYTC通過Apaf1和pro-caspase9產(chǎn)生凋亡體，將procaspase9切割成活性二聚體caspase9，介導caspase3的切割[12]。顯然，VEGF-A和VEGF-C信號傳導控制著細胞凋亡的不同階段。因此，同時抑制VEGF-A和VEGFC對HemECs有更顯著的促凋亡作用。

綜上所述，本研究結果顯示，VEGF-A和VEGF-C通過信號通路中的不同蛋白調(diào)節(jié)HemECs的增殖和凋亡。VEGF-A和VEGF-C雙拮抗在體內(nèi)外對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用更為明顯。