ACAT1低甲基化在兒童腎病綜合征發病機制中的作用研究

楊建環 王德選 陳敏廣 邢超

兒童原發性腎病綜合征主要表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫，微小病變型是最常見的病理類型[1]。目前原發性腎病綜合征的發病機制尚不明確，機體免疫功能紊亂可能參與疾病的發生。酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶（acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase，ACAT）是一種細胞內催化膽固醇代謝的酶，它將細胞內游離的膽固醇催化為膽固醇酯的形式并儲存在細胞內，從而維持細胞膜的膽固醇穩態[2]。目前已鑒定出兩個ACAT基因（ACAT1和ACAT2），其中ACAT1廣泛表達，ACAT2主要表達于肝臟和小腸[3]。研究發現ACAT1表達上調可導致脂質在慢性腎臟病大鼠的腎臟中沉積；而腎臟中脂質積聚可加速腎臟疾病的進展[4]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，通常發生在基因啟動子區域的CpG島上。研究發現，基因啟動子區的DNA甲基化狀態通常與基因轉錄失活有關，而去甲基化狀態則與基因轉錄激活有關[5]。既往研究發現，DNA甲基化異常影響著基因的表達和疾病的發展。而多項研究表明腎病綜合征的發病可能與表觀遺傳改變有關[6-7]；筆者團隊前期研究也發現腎病綜合征患兒的基因組總體甲基化水平降低[8]。目前有關DNA甲基化異常是否影響腎病綜合征患兒ACAT1基因表達的研究不多。基于此，本研究通過分析腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動子的甲基化水平，探討ACAT1甲基化異常在兒童腎病綜合征發病機制中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年6月至2019年12月溫州醫科大學附屬第二醫院收治的原發性腎病綜合征患兒16例，為腎病組，納入標準：（1）蛋白尿：尿白蛋白＞50 mg/（kg·d），或隨機尿白蛋白/尿肌酐＞2 mg/mg；（2）低蛋白血癥：血清白蛋白＜25 g/L；（3）激素治療敏感：4 周內緩解；（4）年齡＜16周歲。排除標準：（1）先天性或遺傳性腎病綜合征；（2）繼發性腎病綜合征（過敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎等）。另擇同時期來醫院體檢的健康兒童16例為對照組。兩組患兒性別、年齡、WBC、Hb、PLT、血尿素氮、血肌酐水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），腎病組患兒血漿白蛋白水平低于對照組（P＜0.05），膽固醇水平、尿白蛋白/尿肌酐高于對照組（均P＜0.05），見表1。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，并經研究對象家屬知情同意。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 ACAT1基因啟動子甲基化水平檢測 采用亞硫酸氫鹽測序法。取患兒外周靜脈血1 ml，用血液基因組DNA提取試劑盒（中國天根生物有限公司）提取全血基因組DNA（操作過程參考說明書）。采用德國Qiagen公司EpiTect bisulfite kit試劑盒對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉修飾（操作過程參考說明書）。經亞硫酸氫鈉修飾后，非甲基化的DNA序列中所有的脫氧胞嘧啶（C）均被轉變為脫氧尿嘧啶（U）；而甲基化CpG島中的脫氧胞嘧啶（C）不會被亞硫酸氫鈉反應，仍然保持CpG序列。將轉化后的DNA模板送檢上海生工生物公司測序，檢測ACAT1基因啟動子的甲基化水平。

1.2.2 ACAT1及DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）mRNA表達水平檢測 取患兒外周靜脈血1 ml，采用Ficoll法提取外周靜脈血單個核細胞，采用Trizol法提取單個核細胞的總mRNA，逆轉錄成第一鏈cDNA。qPCR法檢測ACAT1 mRNA及Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表達水平。反應體系20 μl，包括10 μl FastStart Universal SYBR Green Master的PCR反應試劑（瑞士Roche公司）、每個引物各1 μl（300 nmol/L）、2 μl cDNA 模板和 6 μl去離子水，并在 Roche LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀器中進行PCR擴增，反應條件為 95℃預變性 5 min，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃20 s，共40個循環。所有樣本均設置兩個副管，以βactin作為內參，引物設計見表2。數據結果以2-ΔCt相對定量表示。

表2 引物設計

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎病組患兒和對照組兒童ACAT1 mRNA表達水平比較 腎病組患兒和對照組兒童ACAT1 mRNA表達水平分別為0.14±0.02和0.07±0.01，腎病組高于對照組（P＜0.05），見圖1。

圖1 腎病組患兒和對照組兒童酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（ACAT1）mRNA 表達水平比較

2.2 腎病組患兒和對照組兒童ACAT1基因啟動子的甲基化水平比較 BSP測序結果顯示ACAT1基因啟動子中共有26個CpG島，腎病組患兒和對照組兒童ACAT1基因啟動子的甲基化水平分別為2.36±0.58和4.76±0.81，腎病組低于對照組（P＜0.05），見圖2。

圖2 腎病組患兒和對照組兒童酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（ACAT1）基因啟動子的甲基化水平比較

2.3 腎病組患兒和對照組兒童Dnmt mRNA表達水平比較 腎病組患兒和對照組兒童Dnmt1 mRNA表達水平分別為 0.05±0.01 和 0.09±0.01（P＜0.05），Dnmt3a mRNA表達水平分別為 0.07±0.01和 0.06±0.01（P＞0.05），Dnmt3b mRNA 表達水平分別為 0.08±0.01 和0.06±0.01（P ＞0.05），見圖3；提示腎病組患兒 ACAT1基因啟動子的低甲基化水平可能與Dnmt1 mRNA表達水平降低有關。

圖3 腎病組患兒和對照組兒童DNA甲基化轉移酶（Dnmt）mRNA表達水平比較

2.4 ACAT1甲基化水平、mRNA表達水平與膽固醇水平的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，ACAT1甲基化水平與膽固醇水平呈負相關（r=-0.39，P＜0.05），ACAT1 mRNA表達水平與膽固醇水平呈正相關（r=0.36，P＜0.05），見圖4-5。由于腎病組患兒存在高膽固醇血癥，推測腎病綜合征患兒的膽固醇代謝異常可能與ACAT1基因表達異常相關。

圖4 酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（ACAT1）甲基化水平與膽固醇水平的相關性分析散點圖

圖5 酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（ACAT1）mRNA表達水平與膽固醇水平的相關性分析散點圖

3 討論

原發性腎病綜合征并發癥包括動脈粥樣硬化和血栓栓塞，可能與機體脂質代謝失調和血脂異常有關[9]。ACAT可促使膽固醇的酯化，在維持細胞膽固醇穩態中起重要作用[10]。ACAT1表達上調可促進泡沫細胞的形成，加速腎臟疾病的進展[11]。本研究發現腎病組患兒ACAT1 mRNA表達水平升高，可能與腎病綜合征患兒脂質代謝異常及高膽固醇有關；同時ACAT1表達水平升高可調節T細胞的膽固醇代謝，促進CD8+T的增殖，影響機體T細胞的免疫狀態[12]，從而參與腎病綜合征的免疫功能紊亂。然而，本研究是基于臨床病例對照的研究，可能存在抽樣誤差，還需要進一步大樣本論證。

DNA甲基化通常發生在CpG二核苷酸的5'側胞嘧啶上，而絕大多數CpG位點在細胞的整個周期中保持著甲基化狀態[13-14]。基因組中富含CpG位點的片段稱為CpG島，主要處于啟動子區域，而CpG島的甲基化狀態可直接導致相關基因轉錄沉默[15]。研究發現，在ACAT1基因啟動子中有4個Sp1元件和1個IFN-γ激活序列[16]。其中IFN-γ是一種促進動脈粥樣硬化的細胞因子，它通過與IFN-γ激活序列結合可上調單核巨噬細胞ACAT1 mRNA表達[17]，但對其它類型細胞則無此作用。本研究發現腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動子中有26個CpG島，相對于對照組，其ACAT1基因啟動子甲基化水平降低。由于DNA甲基化通常與基因轉錄失活有關，而去甲基化則與基因轉錄激活有關，因此推測腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動子的低甲基化水平可能與ACAT1 mRNA表達水平升高相關。

Dnmt是體內催化DNA胞嘧啶殘基甲基化的主要反應酶，在哺乳動物細胞中主要包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，它們之間具有協同作用，維持體內DNA甲基化穩定[18]。在正常成人中Dnmt1呈持續性的低表達狀態[19]，從而使人體內部分基因呈去甲基化狀態。既往研究發現，糖尿病db/db小鼠腎皮質中Dnmt1而非Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達水平升高[20]。本研究發現腎病組患兒Dnmt1 mRNA表達水平降低，而Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達水平與對照組比較無統計學差異。因此筆者推測原發性腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動子的低甲基化水平可能與Dnmt1mRNA的表達水平降低相關。

綜上所述，腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動子呈低甲基化狀態，可能與Dnmt1 mRNA表達下調有關，從而使膽固醇代謝出現異常。這為臨床治療兒童原發性腎病綜合征提供新的思路。