TLR4/MyD88信號通路介導LPS抑制CYP4X1表達的分子機制研究

王佳 余緒明 于慧斌 石金敏 余世榮

孤兒細胞色素P450酶系（Orphans Cytochrome P450，CYPs）約占人源的總CYPs的1/4[1]。而孤兒CYPs主要存在于CYP1～4家族，其中CYP4家族占比較大。人源的CYP4X1最初于2002年被發現并命名，它是CYP4新的亞家族成員，也是重要的孤兒CYPs之一[2]。目前，關于CYP4X1的研究不多，現有的研究揭示了CYP4X1的結構、分布、表達調控及功能[3]，此外還闡明了其在各物種間表達的同源性蛋白分析[4-7]。CYP4X1廣泛存在于人體各組織內，其中在腦、肺、腎、肝、胰腺和前列腺內呈高表達，全腦的表達量是肝的2～3倍，小腦和杏仁核的表達量分別是肝的3倍和20倍[8]。眾多研究表明CYP4X1的表達存在晝夜節律調節、性別差異以及年齡差異[6，9-11]。Savas等[12]研究發現，在人肝癌HepG2細胞內，過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）的激動劑Wy14643可誘導其表達，提示PPARα的激活可能影響了人源CYP4X1的轉錄。此外，研究表明CYP4X1參與了內源性物質的代謝、參與調節脂質代謝和與腫瘤密切相關等[13-22]。然而，CYP4X1與炎癥之間的關系如何，在神經炎癥環境下，CYP4X1的表達調控是否受到影響，其調控的分子機制如何，鮮有相關報道。因此，本研究在神經炎癥條件下探討CYP4X1的表達及其分子機制，擬采用神經膠質瘤U251細胞，給予細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）構建離體細胞的炎癥模型，探究CYP4X1在炎癥環境下的表達情況及采用人腎上皮細胞系293T細胞進行瞬時轉染、雙熒光素酶分析實驗探究其調控的分子機制，以期為闡明CYP4X1與神經炎癥之間的關系提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 FBS（杭州四季青生物公司，批號：2104）；DMEM高糖培養基（美國Thermofisher公司，批號：10569044）；opti-MEM培養基（美國Gibco公司，批號：31985-070）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液 100X（美國Thermofisher公司，批號：15140122）；EpiQuikTM染色質免疫共沉淀試劑盒（美國Epigentek公司，批號：P-2002-2）；雙熒光素酶分析試劑盒（美國promega公司，批號：E1910，Lot.220597）；脂質體 2000（美國 Thermofisher公司，批號：11668027）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：15596018,）；LPS 500×（美國 Invitrogen 公司，批號：00-4976-93）；DNA Ladder（碧云天生物公司，批號：D0107）；瓊脂糖（美國 Sigma公司，批號：A9539）；SYBR Premix EX Taq（日本 TAKARA 公司，批號：DRR041A）；I-5TM2X High Fidelity Master Mix（Molecular Cloning Laboratones，批號：I5HM-200）；All-in-one cDNA Synthesis SuperMix（美國 Biotool公司，批號：B24403）；GoldViewⅡ型核酸染色劑（5000×）（北京索萊寶公司，批號：G8142）；Toll樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）抑制劑 CLI-095（美國 InvivoGen 公司，批號：tlrl-cli95）；髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抑制劑 ST 2825（美國 Medchem Express公司，批號：HY-50937）；膠回收試劑盒（美國BiomiGA公司，批號：122131-2）；AxyPrep質粒DNA小劑量試劑盒（美國AxyGEN公司，批號：AP-MN-P-4）；空載pDONR223質粒（湖南優寶生物公司），人源的過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（NM_138712）cDNA克隆質粒（湖南優寶生物公司，批號G111467）和人源的核受體視黃醛X受體α（retinoid-X receptor alpha，RXRα）（NM_002957）cDNA 克隆質粒（G111467，湖南優寶生物公司）；pGL4.11[luc2P]質粒（VT1728，湖南優寶生物公司）；CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報告質粒（武漢思特進科技發展有限公司）；U251細胞和人胚腎細胞293T（武漢大學基礎醫學院樂江教授實驗室）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U251細胞和293T細胞分別于DMEM（含10%FBS，1%雙抗）的培養基中培養，37℃、5% CO2培養箱恒溫培養。六孔板內細胞密度達到70%左右時，將完全培養基棄去，PBS沖洗1～2次，更換無血清培養基給藥或其他操作。

1.2.2 Real-Time RT-PCR檢測CYP4X1和PPARγ的表達 U251細胞分別給予LPS（0.1和1 μg/ml）處理；U251細胞先分別給予CLI-095（1 μmol/L）和ST 2825（20 μmol/L）預處理 1 h 后接著添加 LPS（1 μg/ml），連續培養至24 h，每組設3個復孔。用Trizol法抽提取U251細胞取的總RNA，并測定其濃度（A260/A280）。加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix按如下條件進行逆轉錄得到cDNA樣本，25℃,10 min；42℃，30 min；85℃，5 min。qRT-PCR擴增基因，人源CYP4X1上游引物5'-ACAAACAGCACCCATGATCCT-3'，下游引物5'-ACACTCGGCTTAACTTCTGGA-3'；人源的 PPARγ 上游引物5'-GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3'，下游引物5'-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3'；人 源 的 CYP4X1（ChIP）上游引物 5'-TAGAACTGTCCAAGCCTCAG-3'，下游引物 5'-TCCTCTATGCCCTATTCCTC-3'；人源的GAPDH上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游引物 5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'；qRTPCR 的擴增體系：目的基因 cDNA 2 μl，SYBR mix 5 μl，forwardprimer 0.3 μl，reverseprimer 0.3 μl，DEPC H2O 2.4 μl；Bio-rad RT-PCR檢測系統設置反應條件為95℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。

1.2.3 U251細胞瞬時轉染人源的PPARγ/RXRα表達質粒 U251細胞于6孔板中培養，實驗分組：空載組（pDONR223質粒）和轉染組（人源PPARγ/RXRα表達）。采用Lipofectamine 2000轉染試劑盒進行操作，轉染體系為質粒 DNA 濃度 1 μg：Lipo2000 3 μl，分別用250 μl opti-MEI優化培養稀釋并配置成Mix液，室溫孵育放置10～20 min，加無血清培養基后繼續培養24 h。qRT-PCR檢測CYP4X1的表達水平。

1.2.4 雙熒光素酶分析實驗 通過生物信息學軟件預測分析，將CYP4X1啟動子上預測含有PPARγ/RXRα結合位點（與起始密碼子ATG的位置-1971至-1951 bp）的片段（與起始密碼子ATG的位置-2066至-1763 bp，共303bp）插入pGL4.11質粒中構建CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報告質粒。報告質粒的合成由武漢思特進科技發展公司提供。293T細胞培養于6孔板，實驗分為對照組和轉染組。對照組轉染空載pDONR223質粒+CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報告質粒，轉染組則為人源PPARγ/RXRα表達質粒+CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報告質粒。按照Lipo2000轉染試劑盒和雙熒光素酶分析試劑盒說明操作，每組平行設3個復孔，ModulusTM單管型多功能檢測儀測定熒光強度，計算相對熒光強度。

1.2.5 免疫共沉淀分析實驗 在U251細胞內，實驗分為對照組（DMSO 處理）、LPS（1 μg/ml）組、LPS+CLI-095（1 μmol/L）組和 LPS+ST 2825（20 μmol/L）組，每組設3個復孔。按照ChIP試劑盒提供的方法進行實驗。調整每皿U251細胞密度為2×106～2×107/ml，按上述分組分別處理，細胞計數，1%甲醛溶液固定，室溫孵育10 min。加入1 ml的1.25 mol/L的甘氨酸終止交聯。超聲處理DNA，將其打碎成500～1 000 bp的片段。測定染色質濃度，將大約10%的染色質預留作為Input處理。10 μg的ChIP級單克隆小鼠抗人PPARγ抗體和使用正常的小鼠IgG（ChIP試劑盒提供）作為陰性對照。回收免疫沉淀的DNA，使用PCR純化試劑盒(美國Axygen公司)純化，使用qRT-PCR擴增Input樣本中的DNA以及從沉淀復合物中分離得到的DNA。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上分離，使用Auto Chemi成像系統對條帶強度進行定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4/MyD88信號通路介導LPS抑制U251細胞CYP4X1和PPARγ的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，與空白對照相比，LPS（0.1、1 μg/ml）劑量依賴性抑制U251細胞CYP4X1和PPARγ的表達；CYP4X1的表達下調分別為 38.60%（P＜0.05）、59.90%（P＜0.05），見圖1a；PPARγ 的表達下調分別為 25.17%（P＜0.05）、44.44%（P＜0.05），見圖1b。與空白對照相比，LPS（1 μg/ml）明顯抑制了U251細胞CYP4X1和PPARγ的表達，分別下調 56.92%（P＜0.05）和 46.24%（P＜0.05）。與空白對照相比，TLR4抑制劑CLI-095（1 μmol/L）對CYP4X1和PPARγ的表達無影響（均P＞0.05）；與單用LPS比較，CLI-095聯用LPS明顯衰減了LPS對CYP4X1和PPARγ表達的抑制作用，上調倍數分別為0.9772倍（P＜0.05）和0.3359倍（P＜0.05），見圖1c、d。與空白對照相比，MyD88 抑制劑 ST 2825（20 μmol/L）對 CYP4X1和PPARγ的表達無影響（均P＞0.05）；與單用LPS比較，ST 2825聯用LPS部分衰減了LPS對CYP4X1和PPARγ表達的抑制作用，上調倍數分別為0.5615倍（P＜0.05）和 0.2692倍（P＜0.05），見圖1e、f。即 LPS 主要作用于TLR4/MyD88信號通路進而抑制U251細胞CYP4X1和PPARγ的表達。

圖1 不同劑量脂多糖（LPS）以及CLI-095和ST 2825處理U251細胞后細胞色素P450 X1（CYP4X1）和過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）表達情況比較（*P＜0.05）

2.2 PPARγ在轉錄水平誘導下游靶基因CYP4X1的表達 U251細胞瞬時共轉染PPARγ和RXRα表達質粒，與空載組比較，轉染組CYP4X1的表達水平上調6.62倍（P＜0.05），見圖2，即CYP4X1可能是 PPARγ 的下游靶基因。293T細胞共轉染含有CYP4X1啟動子片段（與起始密碼子ATG的距離-2066至-1763 bp）的報告基因質粒、PPARγ和RXRα表達質粒，與空載組比較，轉染組熒光強度上調9.63倍（P＜0.05），見圖3，即U251細胞內，PPARγ和RXRα可能形成異源二聚體結合在CYP4X1啟動子（與起始密碼子ATG的位置-1971至-1951 bp）上，在轉錄水平上調控其表達。

圖2 U251細胞內過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）的表達情況（與空載組比較，*P＜0.05）

圖3 293T細胞內過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）與細胞色素 P450 X1（CYP4X1）啟動子結合情況（*P＜0.05）

2.3 LPS通過TLR4/MyD88信號通路抑制U251細胞PPARγ蛋白與CYP4X1啟動子的結合 與空白對照相比，LPS抑制U251細胞PPARγ蛋白與CYP4X1啟動子的結合，下調 65.77%（P＜0.05）；與單用 LPS相比，CLI-095顯著衰減LPS對PPARγ蛋白與CYP4X1啟動子結合的抑制作用，上調1.35倍（P＜0.05）。與單用LPS相比，ST 2825部分衰減LPS對PPARγ蛋白與CYP4X1啟動子結合的抑制作用，上調0.86倍（P＜0.05）。見圖4。

圖4 脂多糖（LPS）對U251細胞內過氧化物酶體增殖劑激活受體 γ（PPARγ）與細胞色素 P450 X1（CYP4X1）啟動子結合的抑制作用（*P＜0.05）

3 討論

TLR4是哺乳動物Toll樣受體家族成員之一。MyD88是一種胞質可溶性蛋白，并且是TLR/MyD88/NF-κB信號通路中一個重要的接頭蛋白分子，即關鍵信號適配器。TLR4特異性識別LPS，進而觸發細胞炎癥反應。研究顯示細胞內主要存在兩條TLR傳導途徑：一種是由MyD88銜接蛋白介導的MyD88信號通路；另一種是非依賴性MyD88信號通路[23]。實驗發現，在U251細胞中，LPS劑量依賴性抑制CYP4X1的表達，且TLR4/MyD88信號通路介導了這種抑制作用。

PPARγ是一種配體依賴的核轉錄因子，屬于Ⅱ型核激素受體超家族成員。PPARγ調控靶基因表達的機制是，其首先與核受體視黃醛X受體（RXR）如RXRα形成異源二聚體（PPARγ/RXRα），并與輔抑制因子結合成復合物，使PPARγ處于失活狀態。當特異性配體與PPARγ結合后，使PPARγ/RXRα二聚體空間構象發生改變，與輔抑制因子發生脫離和去抑制，并且募集輔激活因子，再與某些基因起始密碼子上游的過氧化物酶體增殖物反應元件結合，從而調控該基因的表達[24]。本研究發現，U251細胞內高表達PPARγ，結果CYP4X1的表達明顯上調。結合生物信息學軟件、雙熒光素酶分析實驗和免疫共沉淀分析實驗證實，PPARγ/RXRα結合于CYP4X1啟動子區域的過氧化物酶體增殖物反應元件，進而在轉錄水平上調節CYP4X1的表達。

綜上所述，本研究結果揭示神經炎癥條件下CYP4X1的表達及其分子機制，即在U251細胞內LPS通過TLR4/MyD88信號通路抑制了PPARγ與CYP4X1啟動子上過氧化物酶體增殖物反應元件的結合，進而在轉錄水平上抑制了CYP4X1的表達。然而，本研究僅在轉錄水平上闡明了LPS抑制CYP4X1表達的分子機制，尚缺乏翻譯后的蛋白質水平數據，后續或可設計在體大鼠神經炎癥模型，進一步驗證這一結論。