113例靜脈血栓栓塞癥患者遺傳性抗凝蛋白缺陷分析

徐琦煜 金艷慧 楊麗紅 李小龍 劉斯奇 王明山

易栓癥是指由于抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等的遺傳性分子缺陷或因存在獲得性血栓形成危險(xiǎn)因素而易發(fā)生血栓栓塞的一類疾病。一般常指典型的靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE），其中深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺栓塞（pulmonary thromboembolism，PTE）最為常見，還包括一些非典型的靜脈血栓形成（內(nèi)臟、肝、上肢、顱內(nèi)靜脈血栓形成）。VTE屬于多基因-環(huán)境因素共同作用的疾病，是一種常見的心、肺血管疾病和死亡原因。隨著對(duì)易栓癥研究不斷深入，臨床發(fā)現(xiàn)獲得性和遺傳性易栓癥對(duì)于VTE的發(fā)生和發(fā)展有著重要的影響。3種生理性抗凝蛋白：蛋白 C（protein C，PC）、蛋白 S（protein S，PS）、抗凝血酶（antithrombin，AT）缺陷是最常見的遺傳性易感因素[1]。目前，我國(guó)對(duì)易栓癥的研究報(bào)道多見于血栓性疾病的家系報(bào)道，群體性研究較少。本研究對(duì)近幾年生活在浙江省溫州地區(qū)無明顯誘因VTE患者的抗凝蛋白進(jìn)行了表型檢測(cè)和基因篩查，并分析患者臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2019年6月至2020年4月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科門診及住院接受治療的VTE患者113例，其中男64例，女49例；年齡19～86（53.4±17.1）歲；DVT 72例，PTE 25例，DVT合并PTE 3例，顱內(nèi)靜脈竇血栓形成13例。患者均經(jīng)彩色多普勒超聲、CT肺動(dòng)脈造影或數(shù)字減影血管造影明確VTE診斷。排除具有明顯誘因如抗磷脂抗體綜合征、骨髓增殖性疾病、肝腎病史、腫瘤、妊娠、口服避孕藥、手術(shù)、長(zhǎng)期臥床等患者，且在未經(jīng)溶栓和抗凝治療前或者至少停藥2周后抽血檢測(cè)。根據(jù)本院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室參考范圍，將AT活性＜75%、PC活性＜70%、PS活性＜60%判斷為抗凝蛋白缺陷。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者采血樣前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 用藍(lán)色真空抗凝采血管采集患者外周靜脈血2.7 ml各2份（0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝）。一份3 000 r/min離心10 min，上層貧血小板血漿用于凝血指標(biāo)檢測(cè)，并于2 h內(nèi)完成；另一份用于DNA提取及PCR擴(kuò)增測(cè)序。

1.2.2 血漿抗凝蛋白表型檢測(cè) 在Stago STA-R Max全自動(dòng)血凝儀（法國(guó)Stago公司）上用發(fā)色底物法檢測(cè)AT活性、血漿PC活性，凝固法檢測(cè)PS活性。在酶標(biāo)儀（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）上用ELISA法檢測(cè)AT抗原含量（用于AT缺陷癥分型）。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 抗凝蛋白基因突變檢測(cè) 采用PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序法。用基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取患者外周血基因組DNA。在ABI The rmal cycler 2720（美國(guó)）擴(kuò)增儀上擴(kuò)增 AT、PC、PS基因相應(yīng)的外顯子及側(cè)翼序列，用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因文庫的基因序列進(jìn)行比對(duì)，尋找基因突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿抗凝蛋白表型檢測(cè)結(jié)果 113例VTE患者中共檢出抗凝蛋白缺陷者33例（29.20%），其中以PS缺陷最多，為16例（14.16%），其次為PC缺陷和復(fù)合缺陷各7例（6.19%），AT缺陷3例（2.65%）。復(fù)合缺陷中PC+PS缺陷 3例（2.65%），PC+AT缺陷和PS+AT缺陷均為2例（1.77%），見表1。所有7例AT缺陷患者中AT抗原含量降低5例，2例正常。

表1 113例VTE患者抗凝蛋白缺陷發(fā)生情況

2.2 抗凝蛋白基因突變檢測(cè)結(jié)果 對(duì)33例抗凝蛋白缺陷患者進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PS基因突變9例；PC基因突變12例，其中c.1318C＞T和c.833T＞C為新發(fā)現(xiàn)的突變；AT基因突變7例，其中c.1346T＞A和c.851T＞C為新發(fā)現(xiàn)的突變。見表2。

表2 抗凝蛋白基因突變信息

2.3 抗凝蛋白缺陷患者的疾病分布 33例抗凝蛋白缺陷患者以DVT為主，共20例（60.61%），其次為顱內(nèi)靜脈竇血栓形成和PTE，分別為7例（21.21%）和6例（18.18%）。見表3。

表3 抗凝蛋白缺陷患者的疾病分布[例（%）]

3 討論

血液中的PC經(jīng)凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活后，成為活化蛋白 C（activated protein C，APC），當(dāng) PC 與內(nèi)皮細(xì)胞PC受體結(jié)合時(shí)，其被激活，效應(yīng)可增強(qiáng)20倍[2]；而PS作為APC的輔因子，可增強(qiáng)其對(duì)活化凝血因子Ⅴ和活化凝血因子Ⅷ的滅活[3]；AT是血漿中重要的抗凝物質(zhì)之一，作為凝血酶和活化凝血因子Ⅹ的天然抑制物，可抑制血栓形成[4]；因此，PC、PS、AT在抗凝過程中起到非常重要的作用，其缺乏可使機(jī)體內(nèi)促凝系統(tǒng)與抗凝系統(tǒng)失衡，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，可增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，是VTE重要的遺傳性危險(xiǎn)因素[5]。血栓不僅危害人類健康，甚至對(duì)人類生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅，只有早期掌握靜脈血栓的遺傳高危因素診斷并指導(dǎo)合理治療才能降低其致殘及致死率。

國(guó)內(nèi)外研究對(duì)PC、PS和AT 3種抗凝蛋白缺陷研究較多。西方VTE患者中抗凝蛋白缺乏的檢出率較低，而亞洲人群檢出率明顯增高[6]。Pabinger等[7]報(bào)道了680例VTE患者中發(fā)現(xiàn)PC、PS、AT缺陷率分別為 2.5%、1.3%、2.8%。與AT及PC缺陷相比，亞洲人群VTE患者PS缺陷更為顯著，PS缺陷常合并PC、AT缺陷，稱為聯(lián)合缺陷，聯(lián)合缺陷使VTE的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。有報(bào)道無誘因VTE患者3種抗凝蛋白缺陷總發(fā)生率為22.6%～64.7%，均以PS缺陷發(fā)生率最高，復(fù)合缺陷發(fā)生率為0.9%～21.2%[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)VTE患者3種抗凝蛋白缺陷總發(fā)生率為26.4%，PS缺陷發(fā)生率最高為14.9%，復(fù)合缺陷發(fā)生率3.4%[10]。本研究顯示，在浙江省溫州地區(qū)無明顯誘因113例VTE患者中，3種抗凝蛋白缺陷總的發(fā)生為33例（29.20%），其中以PS缺陷最多，為16例（14.16%），PC缺陷 7例（6.19%），AT缺陷 3例（2.65%），復(fù)合缺陷7例（6.19%），與上述研究報(bào)道的VTE患者缺陷發(fā)生率結(jié)果接近，但具體到每種單獨(dú)缺陷和復(fù)合缺陷的發(fā)生率有所不同。由此可見，遺傳性PC、PS和AT缺陷的人群分布特點(diǎn)具有地域及種族差異，也是溫州地區(qū)VTE患者重要的遺傳性危險(xiǎn)因素，但不除外本研究中樣本量小導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏倚，需擴(kuò)大樣本量研究進(jìn)一步明確。

依據(jù)血漿抗凝蛋白表型檢測(cè)結(jié)果，遺傳性AT缺陷癥可被分為抗原和活性同步降低的Ⅰ型，以及抗原正常而活性降低的Ⅱ型。有文獻(xiàn)報(bào)道，在所有AT缺陷癥患者中，表現(xiàn)為Ⅰ型缺陷癥的僅占12%，而在出現(xiàn)血栓癥狀的患者中，Ⅰ型卻達(dá)到80%，比例大大增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)的7例AT缺陷中5例為Ⅰ型，占5/7（71.42%）；2例為Ⅱ型，占2/7（28.58%）。從而提示溫州地區(qū)VTE患者中AT缺陷主要表現(xiàn)為Ⅰ型AT缺陷。

實(shí)現(xiàn)易栓癥的危險(xiǎn)因素評(píng)估和明確根本病因需依賴于基因檢測(cè)，其不受患者生理病理狀態(tài)及藥物的影響，可較為全面、準(zhǔn)確地篩查易栓癥的分子病因。遺傳性抗凝蛋白缺陷癥的基因突變形式包括重組突變、點(diǎn)突變、插入/缺失等，除少數(shù)病例外，大多是雜合子缺陷。在中國(guó)，c.565C＞T是最常見的PC基因突變，有大約0.9%發(fā)生率，是一個(gè)顯著的靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因素，其增加了8.8倍靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[12]，在溫州地區(qū)人群中也較為常見。PC基因突變中c.1318C＞T和c.833T＞C突變以及AT基因突變中c.1346T＞A和c.851T＞C為新發(fā)現(xiàn)的突變，豐富了突變數(shù)據(jù)庫。使用PCR測(cè)序的突變篩查方法，本研究在21例先證者(包括5例復(fù)合缺陷)中發(fā)現(xiàn)了9例具有PS基因突變，這一比例（42.8%）與白種人群的PS突變發(fā)現(xiàn)率相似[13]，但測(cè)序不能發(fā)現(xiàn)大片段的插入和缺失突變。有研究認(rèn)為大片段的PS基因異常是測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變者PS缺乏癥的常見原因，需使用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）來分析。因此，PS 基因測(cè)序突變分析未發(fā)現(xiàn)異常者，還應(yīng)進(jìn)一步行MLPA分析[14]，以明確診斷。

抗凝蛋白缺陷癥導(dǎo)致的VTE國(guó)內(nèi)外報(bào)道多以DVT和PTE為主[15]。本研究顯示，VTE患者中以DVT為主，PTE和顱內(nèi)靜脈竇血栓形成例數(shù)類似。本研究中7例顱內(nèi)靜脈竇血栓形成均為PS缺陷，顱內(nèi)靜脈竇血栓形成是一種罕見的腦血管病，約占全部腦血栓形成的3.5%[16]，主要影響年輕人及兒童。導(dǎo)致顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的危險(xiǎn)因素有很多，而涉及到PS缺陷癥導(dǎo)致顱內(nèi)靜脈竇血栓形成方面，并沒有可靠的流行病學(xué)研究[17]。本研究患者均在充分鑒別及排除了其他常見的可能致顱內(nèi)靜脈竇血栓的疾病后，根據(jù)PS活性明顯降低，考慮PS缺陷癥致顱內(nèi)靜脈竇血栓形成，說明PS缺陷可能是無明顯誘因顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的一個(gè)重要遺傳影響因素。

綜上所述，溫州地區(qū)VTE患者中遺傳性抗凝蛋白缺陷率較高，可能是溫州地區(qū)VTE患者常見的遺傳性危險(xiǎn)因素，其中以PS缺陷最為顯著。本研究發(fā)現(xiàn)的PC基因突變中c.1318C＞T和c.833T＞C突變以及AT基因突變中c.1346T＞A和c.851T＞C為新發(fā)現(xiàn)的突變，為溫州地區(qū)易栓癥患者的基因突變積累資料。因此，對(duì)于高危易栓癥人群進(jìn)行抗凝蛋白及基因突變的檢測(cè)，對(duì)明確血栓形成的原因、治療方案的選擇及療程、預(yù)后具有重要的臨床指導(dǎo)意義。