福州MSM 人群中HIV-1 病毒株基因進化分析

近年來，中國沿海地區的艾滋病患者比例有所增加，尤其是同性戀人群已成為中國沿海城市艾滋病感染的高危人群。其中，同性戀人群中的HIV-1 病毒株亞型分布廣泛，突變率高。子類型包括在歐美流行的B 類型，以及在亞太地區的CRF01_AE 和CRF07_BC[1]。在感染了不同的亞型毒株后，一些患者會產生新的亞型，例如01B，01C 和07B CPX 毒株，這些毒株在中國沿海城市中很流行，而且艾滋病毒在男同性戀者中的傳播也很復雜[2]。目前，尚無關于福州流行株的分子特征和起源的報道。當前的研究表明，HIV-1 基因的突變將存在于不同的病毒株亞型中，并且病毒基因重組的能力是HIV-1 病毒突變的基本原因。這也解釋了艾滋病在全球范圍內難以控制的主要原因。CRF07_BC 在全國范圍內引起暴發[3-4]，遺傳突變正變得越來越明顯，尤其是在感染了CRF07_BC 亞型的人群中，既有吸毒者又有高危男性[5]。目前流行株的全基因組序列變異和重排，但國內主要流行株的基因組分析報道很少，特別是MSM 人群中CRF07_BC 亞型株全基因序列的進化分析。同性戀人群中CRF07_BC 亞型的蛋白結構和功能對該亞型的病毒傳播能力有影響，從而本研究對該亞型基因特征進行研究[6-7]。男同人群中HIV 感染率不斷提高已引起世界的重視，關于性行為和感染相關性的調查正在深入。男同人群中HIV-1 不同基因型是否會引起世界流行也收受到的重點關注。通過基因進化樹分析，追溯病毒的起源并分析該亞型的暴發和主要傳播方式，為HIV-1 在男同人群中的流行和暴發提供預警作用，為HIV-1 的防控提供科學依據[8]。本研究的重點是對福州地區的HIV-1 的整個基因組的測序，對福州地區HIV-1 新重組毒株的基因特征的分析。并男同性戀的主要亞型CRF_07BC 的起源和流行趨勢判斷。從而對新流行毒株的病毒爆發趨勢進行預防措施。

1 材料與方法

1.1 CRF07_BC 型血清標本中獲得cDNA

收集2011 年1 月—2016 年12 月95 份福州疾病預防控制中心HIV-1 確診患者血清標本，用日本TAKARA 公司的病毒RNA提取試劑盒；通過美國Invitrogen 公司的RNA 的反轉錄試劑盒獲得cDNA。以下是本研究采用的反轉錄引物序列：3’端引物：R3.B3R（5’-ACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3）。

1.2 env 基因擴增與進化樹分析

Env 的基因片段的擴增，是通過日本TAKARA 公司的Taq 聚合酶，采用槽式PCR 法進行擴增。

第一輪PCR：

Primer-F：5’-TAGAGCCCTGGAACCATCCAGGAAG-3’

Primer-R：5’-TAGCCCSTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTT-3’

第二輪PCR：

Primer-F：5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGA AG-3’

Primer-R：5’AGCTGGATCCGTCTCGAGATACTGCTCCCAC-3’

1.3 基因組測序與進化樹分析

福州地區HIV-1 病毒的全基因組[9]可以通過不同軟件分析病毒基因的重組位點，其中BEAST v1.10、MEGA5.0、和 SimPlot_v3.5.1 三種生物軟件用于新重組株的進化樹分析，以及病毒基因進化和追溯起源的分析。

1.4 統計學分析

測序結果采用SPSS 版本17.0 軟件進行統計分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CRF07_BC 亞型HIV-1 的env 基因的進化樹分析

福州地區的HIV-1 病毒的env 基因序列進化分析結果表明46份核酸陽性中CRF_07BC 亞型18 株。本研究通過18 株CRF07_BC 亞型病毒株的env 基因序列進化樹分析，結果表明福州地區的CRF07_BC 亞型主要來自印度C 亞型和緬甸的B'亞型重組而成的病毒株，傳入中國云南后通過河南和江西等地進行二次傳播到福州地區，所以福州地區CRF07_BC 病毒與云南、河南和江西地區的HIV-1 代表株有較高同源性，序列相似度為95.1%～98.3%，見圖1。且在MS M，IDU 和其他的人群中流行的CRF07_BC 也與云南和河南等地的代表株同源性高，見圖1。

2.2 CRF07_BC 亞型病毒株的Diversity plot 分析

對CRF07_BC 亞型 的HIV 病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）進行全基因測序分析，結果表明全基因測序結果病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）是由B 亞型和C 亞型的重組株，見圖2。圖2 對不同亞型的毒株用顏色代表，其中參考序列是中國最流行的HIV-1亞型。圖2 CRF07_BC 參考株（97CN54）和福建新重組株（BC.FJFZ.2013.MSM6）。其中福建地區HIV-1 病毒新重組株基因中有五個重組位點，BC.FJFZ.2016.MSM6 的原始堿基主要來自C 亞型，而且在gag，pol 等基因的五個SNP 與CRF07_BC 參考株（97CN54）一致。

3 討論

盡管目前有許多關于HIV-1 突變的研究與報告[9]，本研究重點研究對象是福建沿海地區的福州，通過該地區的CRF07_BC 亞型的基因進化進行分析，研究結果表明福州地區的HIV-1患者的病毒同源性與男同和注射吸毒者同源性高。本研究結果也顯示福建MSM 人群中HIV-1 病毒的基因在變異，這也進一步說明了，福州地區的CRF07_BC 亞型HIV-1 病毒不斷提高流行比例。

圖1 CRF07_BC 亞型病毒株的env 基因序列進化樹分析

圖2 福州地區CRF07_BC（BC.FJFZ.2016.MSM6）的Diversity plot 分析

中國的HIV-1 病毒主要從20 世紀90 年代從緬甸等地區傳入云南[10]。基因進化分析數據也表明了吸毒人群中CRF07_BC 和CRF08_BC 比例在不斷增加，說明該亞型已緬甸傳入中國。在中國，B 和C 亞型的重組形成新重組株，再并通過毒品傳播路徑擴增至全國各地。近年來CRF07_BC 在我國的流行率較高，尤其是在年輕MSM 人群中一直處于上升趨勢，并且在部分地區已經成為主要亞型。在該國各個地區進行了福州男同性戀的流行和CRF07_BC 病毒的流行。結果表明，該新重組病毒株主要來自云南，河南和江西[11]。當第一個CRF07_BC 亞型HIV-1 進入云南地區時，通過在IDU 患者中傳播，并通過MSM/ IDU 雙高危人群進行二次傳播到福州。因此，MSM/ IDU 雙重高危人群在第二次HIV-1 流行病向全國各地蔓延中起關鍵作用。

BC.FJFZ.2016.MSM6 基因組進化分析結果，目前福州地區主要流行的CRF07_BC 亞型與參考值株（97CN54）序列基本一致。由于福州地區人流復雜來自世界各地，今年通過不同方式傳播到了中國的其他發達地區[12]。因此，福州的CRF07_BC 向中國其他地區擴散的方式復雜。HIV 的重組亞型多樣性性，且不同亞型的HIV-1 病毒傳播途徑和耐藥性也在改變。因此，及時對福州地區男同人群中HIV-1 亞型的變化以及識別新的CRF 和URF 病毒重組株進行追蹤，從而有利于對福州地區HIV-1 男同人群中合理使用抗逆轉錄病毒藥物，開發新藥和開發疫苗提供依據。