蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)與鉆喙蘭(Rhynchostylis retusa)遠緣雜交種子無菌播種及后代表型分析

陳和明 呂復(fù)兵 李 佐 肖文芳

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣州 510640)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)因其花形奇特、花色艷麗、色澤豐富、花序整齊、花期長，素有“洋蘭皇后”的美稱。蝴蝶蘭是目前世界上銷售量最大的蘭花品種，全球年消費量已超過2.8 億株[1-2]。近年來，通過雜交育種技術(shù)已培育出許多蝴蝶蘭的優(yōu)良新品種，支撐了蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，但多數(shù)蝴蝶蘭沒有香味、缺乏藍色花且抗性較差[2-3]。因此，將蝴蝶蘭近緣屬野生種質(zhì)資源的優(yōu)良基因通過遠緣雜交的方式導(dǎo)入蝴蝶蘭中，豐富蝴蝶蘭的基因庫和提高蝴蝶蘭的品質(zhì)具有重要的理論和實踐意義。

鉆喙蘭屬(Rhynchostylis)植物有較高觀賞價值，其花色淡雅且多數(shù)具芳香，花序飽滿，花朵數(shù)多達上百朵，形似一條毛茸茸的狐貍尾巴，俗稱“狐尾蘭”，植株抗性較強[4]。已發(fā)現(xiàn)的鉆喙蘭屬約6 種，分布于熱帶亞洲，我國有2 種，產(chǎn)于南方熱帶地區(qū)，分別為鉆喙蘭(R.retusa)和海南鉆喙蘭(R.gigantea)[5]。蝴蝶蘭與鉆喙蘭遠緣雜交組合最早于1965年在英國皇家園藝學(xué)會(RHS)上登錄，此雜種以鉆喙蘭為母本，朵麗蘭為父本，新雜交屬名為Rhynchonopsis，雜種名為Winona Jordan，目前共獲得41 個雜交組合在RHS上正式登錄[6]，其中：以蝴蝶蘭為母本、鉆喙蘭為父本的雜交組合40 個，以鉆喙蘭為母本、蝴蝶蘭為父本的雜交組合1 個。

蝴蝶蘭遠緣雜交研究主要有：張志勝等[7]研究了中國蘭花與蝴蝶蘭等氣生蘭的遠緣雜交，但與蝴蝶蘭雜交成功率極低且未獲得雜種后代；李枝林等[8]報道了蝴蝶蘭與蘭屬的碧玉蘭進行屬間雜交不成功的情況；Kim等[9]研究了風(fēng)蘭(Neofinetiafalcata)與蝴蝶蘭之間的遠緣雜交并獲得雜種后代；陳和明等[10]對蝴蝶蘭與火焰蘭(Renanthera)進行正反遠緣雜交，共計完成雜交組合48 個，獲得441 株雜交后代。然而，蝴蝶蘭與鉆喙蘭(R.retusa)遠緣雜交研究尚未見報道。因此，本研究擬以18 份蝴蝶蘭與鉆喙蘭(R.retusa)為研究對象，主要利用鉆喙蘭花數(shù)多、有氣味且抗性較強的優(yōu)良性狀，進行蝴蝶蘭與鉆喙蘭之間的遠緣雜交試驗，觀察和分析種子的無菌播種和后代的表型性狀，旨在選育出抗性較強、有香味或多花的遠緣雜交新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以聚寶紅玫瑰(P. Jiuhbao Red Rose)、光芒四射(P. Formosa Sunrise)、翔鳳(P. Jiuhbao Red Rose‘Xiangfeng’)、斯卡利特(P. Scarlet in Snow)、沙拉金(P. Brother Sara Gold)、富樂夕陽(P. Fuller’s Sunset)、小櫻桃(P. Jiaho Cherry)、珍珠紅(P. Sunrise Firebird)、紅冠(P. Frigdaas Spring Rose ‘Hongguan’)、宮粉(P. Jiuhbao Red Rose‘Gongfen’)、童真(P. Brother Sara Gold ‘Tongzhen’)、魅力(P. KV Charmer)、小飛象(P. Sogo Vivien)、日本滿天紅(P. Queen Beer ‘Japan’)、滿山紅(P. Chin-Lih Rose ‘Mansanhon’)、熒光蝴蝶蘭(P.violacea)、版納蝴蝶蘭(P.mannii)和朵麗蘭(P.pulcherrima)等18份蝴蝶蘭，以及鉆喙蘭(R.retusa)(圖1，圖2)作為遠緣雜交親本(表1)。其中，蝴蝶蘭自然花期3—6月，鉆喙蘭自然花期5—6月，均種植于廣東省名優(yōu)花卉種質(zhì)資源庫蘭花圃內(nèi)。

圖1 鉆喙蘭開花植株

圖2 鉆喙蘭花

1.2 雜交授粉

2013—2015年的5—6月，對蝴蝶蘭和鉆喙蘭互為親本進行正反雜交授粉各5朵，雜交方法參照Kim等[9]和陳和明等[10]的方法。在開花期選擇晴天10：00—12：00進行雜交，挑選開放3～5 d的花朵，用消毒過的鑷子取下蝴蝶蘭新鮮的花粉塊，然后用鑷子輕輕地把花粉塊置入鉆喙蘭的柱頭里，同樣取下鉆喙蘭新鮮的花粉塊并置入蝴蝶蘭的柱頭里進行正反雜交，并對雜交的花朵掛上標簽并注明雜交組合及授粉時間，同時套袋以防昆蟲授粉，7 d后拆除套袋，待果莢成熟后進行無菌播種。

1.3 種子無菌播種

種子無菌萌發(fā)：將果莢流水沖洗30 min并用70%乙醇表面滅菌1 min，在超凈工作臺上用0.1%的HgCl2處理10 min，再用無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干殘余水分后，用解剖刀剖開果莢并觀察里面的種子情況，然后用無菌鑷子將種子輕輕夾到以下3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為M1：花寶1號3 g/L+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；M2：花寶1號 3 g/L+BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；M3：花寶1號3 g/L+BA 2.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L，以上培養(yǎng)基分別添加蔗糖30.0 g/L+椰汁100.0 ml/L+瓊脂7.0 g/L，每個處理接種3瓶。以胚突破種皮形成白色原球莖為標準統(tǒng)計萌發(fā)率。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25～28 ℃，前期暗培養(yǎng)或有散射光即可，后期光照強度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。

增殖與分化培養(yǎng)：將萌發(fā)后呈嫩綠色的原球莖接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基分別為L1：花寶1號3 g/L+BA 1.0 mg/L+Ad 1.0 mg/L；L2：花寶1號3 g/L+BA 2.0 mg/L+Ad 2.0 mg/L；L3：花寶1號3 g/L+BA 3.0 mg/L+Ad 3.0 mg/L。每個處理接種3瓶，每瓶10個原球莖，培養(yǎng)100 d后在超凈工作臺統(tǒng)計增殖的芽數(shù)量，并轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基花寶1號3 g/L+BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L 上進行分化培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基分別添加蔗糖30.0 g/L+椰汁100.0 ml/L+瓊脂7.0 g/L。培養(yǎng)條件：光照強度1 500～2 000 lx，光照12 h/d，培養(yǎng)溫度25～28 ℃。

壯苗和生根培養(yǎng)：將已分化的苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基分別為T1：花寶1號3 g/L+NAA 0.1 mg/L；T2：花寶1號3 g/L+NAA 0.5 mg/L；T3：花寶1號3 g/L+NAA 1.0 mg/L，以上培養(yǎng)基分別添加蔗糖30.0 g/L+椰汁100.0 ml/L+瓊脂7.0 g/L。每個處理接種5 瓶，每瓶10 個芽苗，培養(yǎng)100 d后統(tǒng)計小苗的葉片數(shù)、葉片長度、葉片寬和根數(shù)及根長。培養(yǎng)條件：光照強度1 500～2 000 lx，光照12 h/d，培養(yǎng)溫度25～28 ℃。

1.4 雜種后代調(diào)查

2017年6月雜種F1代實生苗出瓶移栽，經(jīng)過小苗、中苗和大苗的栽培管理后，雜種F1實生苗在2020年3—5月陸續(xù)開花，開花期參照Vo等[11]以及陳和明等[10]的方法調(diào)查雜種F1代和親本植株的開花階段的相關(guān)性狀，調(diào)查開花率，以及6個數(shù)量性狀：葉長、葉寬、花梗長、花梗粗、單枝花朵數(shù)、花徑；假質(zhì)量性狀12個：葉片形狀、葉色、花梗顏色、花梗姿勢、萼片形狀、花瓣形狀、萼片主色、花瓣主色、唇瓣主色、花香、移植至成苗始花、開花期。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭和鉆喙蘭正反遠緣雜交的座果率差異

不同品種的蝴蝶蘭與鉆喙蘭遠緣雜交座果率差異明顯(表1)。由表1可見：在36個正反遠緣雜交中，以蝴蝶蘭為母本、鉆喙蘭為父本的雜交組合18個，有12個雜交組合座果，其組合座果率在20%～80%均有；以鉆喙蘭為母本、蝴蝶蘭為父本的雜交組合18個，但所有的組合均未座果，座果率為0%且授粉后5～10 d全部蔫萎凋謝；以蝴蝶蘭為母本，鉆喙蘭為父本座果的12個雜交組合中，果莢發(fā)育時間超過100 d的僅有1個，為PR01(蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’×鉆喙蘭)，果莢發(fā)育時間60～90 d，共有9個，分別為PR05、PR09、PR13、PR15、PR23、PR27、PR29、PR31和PR35，而30～60 d僅有2個，為PR19和PR21(表1)。

2.2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對遠緣雜交種子萌發(fā)的影響

由表1可知，12個成功座果的雜交組合均是以蝴蝶蘭為母本、鉆喙蘭為父本，種子經(jīng)無菌播種、在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，只有PR01(蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’×鉆喙蘭)的種子萌發(fā)(圖3(a)和(b))，且在M1、M2、M3的3 種培養(yǎng)基上均能萌發(fā)，萌發(fā)率達到100%，但其原球莖形成時間和轉(zhuǎn)綠時間有所不同，隨著生長調(diào)節(jié)劑濃度的升高，所需時間變短；PR05、PR09、PR13、PR15、PR19、PR21、PR23、PR27、PR29、PR31及PR35雜交組合的種子在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 年均未萌發(fā)(圖3(c)和(d))。結(jié)合表1可知，PR01的果莢發(fā)育時間達到110 d，而PR05、PR09、PR13、PR15、PR19、PR21、PR23、PR27、PR29、PR31和PR35的果莢發(fā)育時間在 30～90 d，這些果莢與PR01相比，可能因為發(fā)育時間不足、種胚未能形成，導(dǎo)致種子不能萌發(fā)。

表1 不同品種蝴蝶蘭與鉆喙蘭正反雜交及座果率

2.3 遠緣雜交后代(PR01)的增殖

由于僅PR01(蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’×鉆喙蘭)雜交后代的種子萌發(fā)，因此，只對PR01的原球莖進行了增殖研究，不同激素水平對PR01原球莖增殖的影響結(jié)果見表2。由表2可知，在接種的各處理的30 個原球莖中，L1處理的增殖系數(shù)為2.0，而L2和L3處理的增殖系數(shù)分別達到3.1和3.3，表明處理L2和L3，即BA 2.0～3.0 mg/L、Ad 2.0～3.0 mg/L 適合于PR01原球莖的增殖。從圖3(a)、(b)和(e)來看，圖3(a)為雜交組合PR01的果莢，圖3(b)為PR01種子萌發(fā)長成原球莖，圖3(e)為PR01原球莖的增殖情況；而圖3(c)和(d)為果莢發(fā)育時間為30～90 d的果莢，以及無菌播種后不萌發(fā)的情況。

表2 不同激素水平對PR01原球莖增殖的影響

2.4 遠緣雜交苗(PR01)的壯苗生根

將PR01分化的幼苗(圖3(f))轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)100 d后，結(jié)果見表3。由表3結(jié)果可以看出，3個處理T1、T2、T3，在葉片數(shù)、葉片長、葉片寬上無顯著差異，但根數(shù)和根長上具有明顯差異，表現(xiàn)在根數(shù)量T1、T2與T3之時存在顯著差異，而T1和T2之間差異不明顯，根長T2、T3與T1差異明顯，但T2、T3之間不存在差異。因此，T2有利于PR01無菌苗的壯苗生根(圖3(g)和(h)。

(a)發(fā)育時間充足的果莢(雜交組合PR01)；(b)PR01種子長成原球莖；(c)發(fā)育時間不充足的果莢；(d)種子無菌播種后不萌發(fā)；(e)PR01原球莖的增殖；(f)PR01分化成苗；(g)PR01壯苗生根；(h)PR01移栽種植。

表3 不同培養(yǎng)基對PR01壯苗生根的影響

2.5 遠緣雜交后代F1(PR01)的數(shù)量性狀分析

2017年6月雜種F1代(PR01)實生苗出瓶移栽，經(jīng)過3年的生長，于2020年3月始花，其后代開花率及其主要數(shù)量性狀見表4。此雜種F1群體植株數(shù)141株，但開花株數(shù)僅有22株，開花率為15.6%；而母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’和父本鉆喙蘭的開花率均為100%，表明經(jīng)過遠緣雜交后，雜種F1的開花不一致，出現(xiàn)了性狀分離(表4)；從葉長和葉寬的性狀來看：母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’和父本鉆喙蘭的葉長均值分別為17.3、36.0 cm，葉寬分別為6.8、2.5 cm，子代F1葉長、葉寬分別為20.1、5.4 cm，介于雙親之間(表4)；母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’和父本鉆喙蘭的花梗長分別為71.7、43.8 cm，花梗粗分別為6.3、3.2 mm(表4)，單枝花朵數(shù)分別為9、54朵，花徑分別為9.7、1.7 cm，子代F1的花梗長、花梗粗、單枝花朵數(shù)和花徑分別為37.4 cm、3.8 mm、9.2朵和5.3 cm，與雙親比較除了花梗長比雙親小，花梗粗、單枝花朵數(shù)和花徑均介于雙親之間，但葉長、葉寬、單枝花朵數(shù)和花徑趨向于母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’(表4)。

表4 PR01親本及F1的開花率及其主要數(shù)量性狀

2.6 遠緣雜交后代F1(PR01)的假質(zhì)量性狀分析

從表5雜種F1和親本主要假質(zhì)量性狀來看，子代F1葉片形狀均為窄倒卵圓形(圖4(c))，介于母本倒卵圓形(圖4(a))和父本披針形(圖4(b))之間；子代F1葉色、花梗顏色均為綠色，以及花梗姿勢表現(xiàn)為直立，均與母本一致；子代F1萼片形狀、花瓣形狀均為卵圓形，介于雙親之間，但無論是葉片、花梗還是萼片、花瓣均趨向于母本；從花的主色分析，母本萼片、花瓣的主色均為深紫(N57-A)(圖4(e))，父本萼片、花瓣的主色均為白色(NN155-D)(圖4(e))，而子代F1的萼片、花瓣主色表現(xiàn)為從深紫(N57-A)、紫紅(N57-B)、粉紅(N57-C)、淺粉(N57-D)和淡粉(62-B)均有(圖4(d)和(e))，介于母本萼片、花瓣主色深紫(N57-A)，父本鉆喙蘭萼片、花瓣主色白色(NN155-D)之間，而母本唇瓣主色為深紫(58-A)(圖4(e))，父本唇瓣主色為淡紫(58-D)(圖4(e))，子代F1唇瓣主色分別表現(xiàn)為深紫(58-A)、紫紅(58-B)和淺紫(58-C)(圖4(d)和(e))，因此，無論從萼片、花瓣主色，還是唇瓣主色，子代F1的主色均介于雙親之間，表明子代遺傳了親本的花色。同時，子代F1均無香味，而母本無香味，但父本鉆喙蘭有氣味，但不香(表5)。植株從移植至成熟大苗始花，母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’需2年，父本鉆喙蘭需4年，而子代F1需3年，表明子代從移植至成熟大苗的始花時間介于雙親之間，但開花期子代與母本相近，表現(xiàn)為3—5月(表5)。

表5 雜交后代株系F1(PR01)與親本主要假質(zhì)量性狀的比較

(a)母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’植株；(b)父本鉆喙蘭植株；(c)子代F1(PR01)的植株；(d)F1植株(PR01)開花情況；(e)子代F1(PR01)花色分離。

3 討論與結(jié)論

蘭花遠緣雜交存在屬間親和性低的問題，因此，雜交組合成功的座果率較低[12]。屬間雜交親和性低主要表現(xiàn)在遠緣雜交過程中雌性障礙[13]或花粉不育[14]，導(dǎo)致提早落果或果莢發(fā)育不充分。Kim等[9]在風(fēng)蘭(Neofinetiafalcata)與蝴蝶蘭遠緣雜交研究中得出，26%的雜交組合中，種子持續(xù)生長3～4個月，才能形成正常的種胚。本試驗中，以鉆喙蘭為母本、蝴蝶蘭為父本的雜交組合，在授粉雜交后5～10 d全部發(fā)育不成功(表1)；以蝴蝶蘭為母本、鉆喙蘭為父本的雜交組合，果莢發(fā)育時間達到 90～120 d 的僅有1個，為PR01(蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’×鉆喙蘭)，發(fā)育時間為110 d(表1)，且通過無菌播種并在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后種子均能萌發(fā)(圖3(a)、(b))，但發(fā)育時間為30～90 d的11個果莢無菌播種后均未萌發(fā)(表1，圖3(c)和(d))，研究結(jié)果與Kim等[9]、陳和明等[10]和Kishor等[22]的結(jié)果一致。

蘭花種子一般采用無菌播種的方法進行繁殖，由于種子無胚乳，所含營養(yǎng)物質(zhì)極少，在自然環(huán)境中極難萌發(fā)[15]。在試驗中，12個座果的雜交組合，其果莢分別在M1、M2、M3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上無菌播種后，只有PR01的種子在3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)，且在M2、M3的培養(yǎng)基上，PR01的原球莖形成時間和變綠時間較快，與歐陽英等[16]、丘亮偉等[17]的研究結(jié)果一致。在PR01種子的增殖過程中進行了不同濃度的6-BA和Ad配比研究，結(jié)果表明處理L2和L3，即BA 2.0～3.0 mg/L、Ad 2.0～3.0 mg/L有利于原球莖的增殖(表2)，這與王玲等[18]、崔廣英等[19-20]的研究結(jié)果相似，即6-BA和NAA搭配使用，增殖效果更佳。

壯苗生根培養(yǎng)能夠提高出苗成活率，此階段一般需要降低培養(yǎng)基的激素或生長調(diào)節(jié)劑的濃度，以利于形成健壯幼苗。李金雨等[21]認為，生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.5 mg/L+10%香蕉泥與MS+IBA 0.5 mg/L+10%香蕉泥對生根的影響，兩者之間無差異，其余的處理間均在0.01水平上存在極顯著差異，其中以NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁的培養(yǎng)基對生根的效果最好，平均生根數(shù)達3.6 條；同時，試驗結(jié)果進一步表明，椰子汁或香蕉泥等對生根具有良好的促進作用。本試驗中，壯苗生根培養(yǎng)基T2，即花寶1號3 g/L+NAA 0.5 mg/L，同時添加蔗糖30.0 g/L+椰汁100.0 ml/L+瓊脂7.0 g/L最有利于PR01壯苗生根，平均根數(shù)量達到3.0 條，根長4.0 cm(表3)，說明較低濃度的NAA并添加適量的椰子汁促進了PR01后代株系的生根壯苗。

PR01遠緣雜種F1株系在葉片大小、花梗粗、單枝花朵數(shù)和花徑等數(shù)量性狀，以及花色(包括花萼、花瓣和唇瓣)、葉色、花梗顏色、葉片形狀、萼片形狀、花瓣形狀等假質(zhì)量性狀均介于雙親之間，這與已有研究結(jié)果相似[22]。蘭花屬間雜交后代的花色、花梗直立和香味被認為是定性和定量遺傳[23]，本試驗中，母本蝴蝶蘭‘聚寶紅玫瑰’的花色為深紫紅，父本鉆喙蘭花色主要表現(xiàn)為白色，在PR01遠緣雜種F1中，大部分株系均表現(xiàn)接近蝴蝶蘭的花色性狀，而以白色為主的鉆喙蘭花色在F1中也有體現(xiàn)(圖4(d)和(e))，花梗直立在F1中與母本一致；相比之下，母本無香味，父本鉆喙蘭有氣味但不香，但子代F1中無香味也無氣味(表5)，表明氣味或香味的遺傳相對復(fù)雜，必須進一步研究。在遠緣雜交后代開花方面，Kishor等[22]在火焰蘭與萬代蘭遠緣雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，雜交后代幼苗移栽后種植4年10個月，僅有10%的植株形成花蕾并成功開花，陳和明等[10]在火焰蘭與蝴蝶蘭遠緣雜交中，雜交后代移植3年后，其開花率為9.8%～37.3%，而本試驗中遠緣雜種PR01移植3年后，其開花率為15.6%，表明蝴蝶蘭與鉆喙蘭遠緣雜種F1株系間開花時間不同，出現(xiàn)了性狀分離。

本研究共設(shè)計遠緣雜交36個組合，僅有1個雜交組合的果莢由于發(fā)育時間充分獲得了種子，經(jīng)無菌播種后種子萌發(fā)并獲得實生苗，雜種后代經(jīng)過3年的種植后開花，其花色及植株性狀產(chǎn)生了分離。同時，蝴蝶蘭與鉆喙蘭的遠緣雜交成功率低，可能與種胚有沒有形成、胚發(fā)育是否正常、胚發(fā)育是否充分或胚齡等有關(guān)。