天津某牧場奶牛乳房炎奶樣與環境中細菌的分離與鑒定

胡海燕 劉慧敏 孟 璐 鄭 楠 王加啟 程建波

(1．安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230000；2.中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所/農業農村部奶產品質量安全風險評估實驗室(北京)，北京 100193；3．中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所/動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

乳房炎是奶牛的重要疾病之一，會造成產奶量與乳品質(脂肪、蛋白質、乳糖等)下降[1-2,6]和奶牛壽命減少甚至死亡[3]，影響牧場經濟效益[4]和奶牛福利影響[5]。致病菌感染是奶牛乳房炎患病最主要的原因，總共有100多種微生物可引起乳房炎，這些微生物可分為常見致病菌(包括主要和次要致病菌)以及非常見致病菌。常見致病菌約有20多種，例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等[7]。在奶牛場的大罐乳[8]或單獨擠奶的乳房炎奶樣[9]中，均可檢測到Sta.aureus、Str.agalactiae和停乳鏈球菌(Str.dysgalactiae)等不同的致病菌。環境是乳及乳制品中細菌或引起奶牛乳房炎的致病菌的來源之一。在研究生乳和牛場環境分離的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的流行性和遺傳多樣性時，從生乳以及環境樣品中總共檢測到B.cereus菌株56種，并使用多位點序列分析(Multilocus sequence typing, MLST)分為18種序列類型(Sequence typing, ST)，其中ST857從空氣、牛棚、臥床、糞便和生乳樣品中均有檢出[10]。此外，在擠奶過程中，致病菌可能通過擠奶工的手、毛巾和奶杯感染；不規則的真空波動會迫使細菌進入乳頭管，從而可能導致新的感染[11]，從而引起奶牛乳房炎。

不同國家和地區引起臨床乳房炎的環境性致病菌存在差異，美國威斯康星州50個大型牧場中，引起乳房炎的致病菌主要是E.coli、環境鏈球菌(Environmentalstreptococci)、Klebsiella和凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulasenegativestaphylococci)[12]，并且產色葡萄球菌(Sta.chromogenes)，表皮葡萄球菌(Sta.epidermidis)和模擬葡萄球菌(Sta.simulans)感染均可造成奶牛乳腺內持續性感染[13]。因此，準確鑒定出奶牛乳房炎感染的病原菌種類并解析其與環境病原微生物之間的相關性是防控治療奶牛乳房炎的關鍵。

本研究以天津某牧場為例，通過美國加州乳房炎檢測(California mastitis test, CMT)方法篩選乳房炎患病牛，采集乳房炎奶樣及相關環境樣品，使用選擇培養基與血瓊脂平板進行細菌的分離鑒定，分析乳房炎奶樣與環境中分離菌株的多樣性，判斷牧場主要流行微生物種類與衛生管理防控薄弱環節，為牧場奶牛乳房炎防控與衛生管理提出建議與意見，為進一步研究乳房炎致病菌溯源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑：10 mL無菌生理鹽水管(帶棉簽)，購自華威銳科(HWRK)；麥康凱瓊脂(Maconkey Agar)，購自索萊寶(Solarbio)；高鹽甘露醇瓊脂，購自OXOID；血瓊脂平板與營養瓊脂斜面均購自北京路橋技術股份有限公司；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR,TaqPCR Master Mix與超純水(ddH2O)為品牌Takara；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

主要儀器：松下立體壓力蒸汽滅菌器，日本；生化培養箱(HPS-250)與生物安全柜(HDL BSC-136011A2)均購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司；移液器(Transferpettes S 50～1 000 μL)，德國Brand；恒溫水浴鍋(GFL-1083)，美國；分析天平(AL-204)，瑞士；均質機(Bag Mixer?400VW)，法國Interscience；PCR儀，美國Bio-rad。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品采集

2019年9月在天津某牧場進行樣品采集，該牧場泌乳牛存欄量約1 500頭，采用大型轉盤式擠奶操作，每天擠奶3次；臥床墊料使用經過干濕分離處理的糞便，并及時更換與補充墊料；牧場大罐奶體細胞數平均低于10萬個/mL。通過CMT方法篩選出6頭乳房炎患病奶牛，體細胞數(Somatic cell count, SCC)均≥1500 000 CFU/mL，奶牛胎次1～3胎。

1)乳房炎奶樣采集：使用無菌采樣瓶，對患病乳區的手工擠奶(200～250 mL)，棄前3把奶。

2)乳頭皮膚及奶杯樣品采集：奶?；疾∪閰^乳頭皮膚以及相對應的奶杯內壁均使用生理鹽水管(10 mL)中棉簽拭子擦拭。

3)糞便樣品采集：采用直腸掏糞方法收集糞便樣品150 g。

4)環境樣品采集：牧場將經過干濕分離曬干后的糞便作為臥床墊料，收集并處理未使用的新墊料(100 g)樣品；在牛舍中采用3點取樣法，隨機選擇3個臥床，采集3份臥床表面墊料(100 g)樣品，混合；隨機選擇飲用水槽，收集患病牛飲用水(250 mL)；空氣采用物理沉降法進行取樣，使用無菌培養皿，靜置于牛舍地面1.5 m高處1 h后進行下一步預處理[14]。新墊料、墊料、飲用水和空氣樣本每隔2 d采集1次，共采集3次。由于天氣轉涼，噴淋水(250 mL)只在采集第1次飲用水時收集，而患病牛飼料(500 g)在第1次與第3次采集。擠奶過程中使用的藥浴液直接傾倒入50 mL離心管，得到前/后藥浴液樣品(50 mL)；并使用生理鹽水管中棉簽拭子擦拭前/后藥浴杯杯口，得到前/后藥浴杯樣品(10 mL)，每隔1天采集1次，共采集9次。采樣過程均使用無菌實驗耗材，試驗樣品信息見表1。

5)收集空氣樣品的培養皿在牧場微生物檢測實驗室進行預處理，使用1 mL移液槍吸取85%生理鹽水反復吹洗，得到15 mL菌液。其他所有樣品在采集后1 h內放置于-20 ℃冰箱冷凍保存，之后使用恒溫箱加冰袋3 h內運送至實驗室進行-20 ℃冰箱冷凍保存，等待后續試驗處理。

表1 采集樣品信息

1.2.2不同樣本中細菌的分離純化

用移液槍分別取6頭乳房炎患病牛奶200 μL，在麥康凱瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂和血瓊脂平板涂布，37 ℃恒溫培養18～36 h后，使用接種環在麥康凱瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂培養基上挑取菌落，血瓊脂平板挑取不同形態、有溶血環的菌落，分別進行平板劃線，分離乳房炎奶樣中可培養的細菌，反復進行純化，直到培養基上生長單一菌落，最后進行營養瓊脂斜面劃線，2～6 ℃保存。

乳頭皮膚、奶杯、飲用水、噴淋水、前/后藥浴液和前/后藥浴杯樣品采用與乳房炎奶樣相同的步驟進行細菌分離純化培養。

分裝糞便、新墊料、墊料、飼料各25 g于225 mL 85%生理鹽水中，均質1 min后，使用移液槍吸取100 μL，在培養基上涂布培養，操作同乳房炎奶樣菌群分離純化步驟。

分離純化步驟均在超凈工作臺中進行。

1.2.316S rDNA PCR鑒定

1)水浴法提取DNA

接種環挑取營養瓊脂斜面分離的菌株于50 μL Lysis Buffer中，80 ℃恒溫水浴鍋加熱15 min，DNA提取完畢，-20 ℃保存。

2)PCR擴增

將水浴法提取的DNA進行PCR擴增，使用16S PCR通用引物[15]

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

1 492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

反應體系為50 μL，分別加入TaqPCR Mastermix 25 μL，上游引物(27F)2 μL，下游引物(1492R)2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。

3)反應條件

預變性：94 ℃，4 min，循環數為1；PCR擴增：94 ℃變性，30 s，57 ℃退火，30 s，72 ℃延伸，90 s，重復循環30次；最后延伸：72 ℃，10 min，循環數為1；保溫：10 ℃，∞。

4)測序結果比對

將測序序列在NCBI上Blast比對，獲取與所測序列相似度高的序列，完成分離純化菌株的鑒定。

1.2.4數據統計

使用Excel對樣品中分離純化細菌進行統計匯總。

2 結果與分析

2.1 乳房炎奶樣品中細菌的分離與鑒定

6頭乳房炎患病牛用藥前牛奶通過選擇培養基麥康凱、高鹽甘露醇以及血瓊脂平板進行涂布、分離、純化培養，經16S rDNA擴增和測序，測序序列在NCBI數據庫進行Blast比對，共鑒定出12株分離株。

鑒定出的分離株分別是1株E.coli，4株葡萄球菌(Staphylococcus)，3株芽孢桿菌(Bacillus)，包括2株堅強芽孢桿菌(B.firmus)和1株地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，其余為海洋放線菌(Kocuria)、羅思氏菌(Rothia)、產吲哚金黃桿菌 (Chryseobacteriumindologenes)、牛黃桿菌(Chryseobacteriumbovis)各1株。

2.2 畜舍樣品中細菌的分離鑒定

畜舍樣品包括7種，分別是乳房炎患病牛糞便(6份)、新墊料(3份)、墊料(3份)、飲用水(3份)、噴淋水(1份)、飼料(2份)和空氣(3份)，共計21份樣品。利用選擇培養基和血瓊脂平板培養，共分離純化得到94株分離株，分類統計見表2和表3。

94株分離株中，主要是Bacillus，在糞便、新墊料、墊料、飲用水、噴淋水、飼料和空氣中分別有22、2、1、8、1、3和8株，共計45株。Bacillus主要包括淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、B.licheniformis、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、B.firmus、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、圓形芽孢桿菌(B.circulans)、嗜熱芽孢桿菌(B.aerophilus)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、安全芽孢桿菌(B.safensis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、平流芽孢桿菌(B.stratosphericus)、B.cereus、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)、銅綠芽孢桿菌(B.aerius)共14種。腸桿菌屬(Enterobacter)未在噴淋水與空氣中分離出來，在糞便(2株)、新墊料(3株)、墊料(4株)、飲用水(2株)和飼料(1株)中分離得到。糞便、新墊料、墊料、飲用水、飼料和空氣中分別分離鑒定出2、1、4、1、1和1株Staphylococcus分離株，共計10株。在新墊料與飼料中分別鑒定出1株Klebsiella，并且在新墊料中分離出一株假單胞菌屬(Pseudomonas)分離株。在畜舍不同樣品中分離出的其他細菌種類有：不動桿菌屬(Acinetobacter)、大洋單孢菌屬(Oceanimonas)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)、嗜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、泛菌屬(Pantoea)、鳥氨酸芽孢桿菌屬(Ornithinibacillus)和產蛋白酶中度嗜鹽菌屬(Thalassobacillus)。

2.3 奶廳樣品中細菌的分離鑒定

奶廳樣品包括6種樣品，分別是前藥浴液(9份)、前藥浴杯拭子(9份)、乳房炎患病牛乳頭皮膚拭子(6份)、奶杯拭子(6份)、后藥浴液(9份)和后藥浴杯拭子(9份)(按照擠奶操作流程排序)，共計48份，利用選擇培養基和血瓊脂平板培養，共分離純化得到111株分離株，分類統計見表4。

表2 畜舍樣品(糞便、新墊料、墊料)中細菌鑒定

表3 畜舍樣品(飲用水、噴淋水、飼料、空氣)中細菌鑒定

表4(續)

111株分離株中，主要是Bacillus，在前藥浴液、前藥浴杯拭子、乳房炎患病牛乳頭皮膚拭子、奶杯拭子、后藥浴液和后藥浴杯拭子樣品中，分別分離鑒定出22、24、14、12、14和12株Bacillus分離株，共計98株。包括B.licheniformis、B.firmus、B.subtilis、B.aerophilus、B.clausii、B.cereus、Lysinibacillus、海洋芽孢桿菌(B.oceanisediminis)、青貯窖芽孢桿菌(B.siralis)、海地芽孢桿菌(B.maritimus)、食苯芽孢桿菌(B.benzoevorans)、類地衣芽孢桿菌(B.paralicheniformis)和維爾茲芽孢桿菌(B.velezensis)共13種。在奶廳樣品中分離出其他細菌包括類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)2株、Halobacillus1株、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)3株、少鹽芽胞桿菌屬(Paucisalibacillus)1株、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)1株、Ornithinibacillus2株和細菌BMV7 3株。

3 討 論

3.1 分離鑒定細菌與奶牛乳房炎患病風險

研究表明，Staphylococcus(如Sta.aureus、Sta.chromogenes、Sta.epidermidis、Sta.simulans)、Coagulasenegativestaphylococci以及E.coli等是導致奶牛乳房炎疾病發生的主要致病菌，且與奶牛乳房炎的持續性感染有關[12-13]，Acinetobacter、Klebsiella、Shigella、Enterobacter均能夠引起不同程度的乳房炎[12,16]，然而在本研究中，奶牛乳房炎奶樣中分離出4株Staphylococcus和1株E.coli，因此，Staphylococcus和E.coli感染可能是引起奶牛乳房炎的致病菌。不同畜舍樣品中也同樣分離出不同種類的Staphylococcus，所以糞便、墊料、飲用水等環境樣品可能是引起奶牛乳房炎致病菌的儲存庫。有研究從50個生乳樣品和300個環境樣品(包括土壤、水、飼料、空氣、奶桶、擠奶機、牛舍、墊料、糞便、乳房、工作服、鞋底和員工手部樣品)中共檢測到B.cereus分離株56種[10]；并且空氣的流動性似乎為致病菌的傳播提供了動力[14]。可進一步通過細菌分型方法探究不同樣品中分離菌株的相關性，為引起奶牛乳房炎致病菌的溯源工作奠定基礎，Nieminen等[17]使用MLST方法在乳制品加工廠發現27株B.cereus分離株的17種ST。

研究表明，存在少數Bacillus如B.cereus、B.pumilus、B.licheniformis即可引起奶牛乳房炎[18-19]。本研究中，分別在奶牛乳房炎奶樣、畜舍和奶廳樣品分離鑒定出Bacillus3、45和98株，尤其在奶廳樣品中分離株的比例較高(98/111株，88.29%)，因此，應當加強奶廳管理及衛生規范，減少細菌在擠奶過程中由乳頭進入乳腺從而定植，或因擠奶真空壓力過大造成乳頭機械性損傷從而感染導致的奶牛乳房炎。大部分Bacillus可能不會引起奶牛乳房炎，但是大量存在的Bacillus對不同抗生素的敏感程度不同，甚至有的菌株攜帶耐藥基因。Agers?等[20]研究不同來源的104株B.licheniformis和副地衣芽孢桿菌(B.paralicheniformis)，發現所有菌株都攜帶aph和aad鏈霉素耐藥基因，cat氯霉素耐藥基因和erm紅霉素耐藥基因，這些基因被認為是B.licheniformis和B.paralicheniformis的固有基因。在本研究中，奶廳樣品中分離鑒定得到比例較高的Bacillus，可能對牧場中使用的抗生素產生了耐藥性或攜帶了耐藥基因，這對牧場奶牛乳房炎的治療提出了巨大挑戰。

3.2 分離鑒定細菌與乳及乳制品質量安全風險

環境樣品中存在的大量細菌，例如Bacillus，不僅可能會引起奶牛乳房炎疾病或增加奶牛乳房炎治療難度，還可能增加生鮮乳質量與安全隱患。本試驗環境樣品共鑒定出205株Bacillus，尤其是奶廳樣品中分離出大量Bacillus(98/111株，88.29%)，主要有B.licheniformis、B.firmus、B.subtilis和B.cereus。Bacillus能形成芽孢，具有一定的耐受力(例如耐高溫、耐低溫、耐氧化，穩定性好等)，廣泛分布在土壤、水、空氣以及動物腸道等；另外，Bacillus具有產生生物膜的能力并且對酸和堿具有耐受性[17]。在多年養殖荷斯坦奶牛的牧場土壤中，分離鑒定出的優勢Bacillus有B.cereus、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、B.lincheniformis[21]。某些Bacillus具有產生腸毒素、細胞毒素、溶血素的能力，越來越多的研究證明B.cereus能夠產生多種毒素而導致食物變質和致病的能力。B.cereus在加納(Ghana)的土壤、生乳和乳制品中普遍存在，并且對β-內酰胺類抗生素(例如氨芐青霉素、青霉素、阿莫西林和頭孢吡肟等)有耐藥性[22]，并且在巴氏殺菌乳中分離得到的B.cereus，攜帶了多種產腸毒素基因(cytK、entFM、bceT和hlyII)，大多數分離株對β-內酰胺類抗生素和利福平有耐藥性，對其他抗生素如環丙沙星、慶大霉素和氯霉素敏感[23]。在畜舍新墊料樣品中分離得到Pseudomonas，研究表明，Pseudomonas在食品以及乳制品中普遍存在，是導致冷藏食品腐敗的重要細菌。生牛乳及非生牛乳(如山羊奶和駱駝奶)中Pseudomonas菌群多樣性高，在冷藏溫度下具有高蛋白水解活性和產生肽酶的能力[24]，從而導致牛奶更容易變質。

3.3 分離鑒定細菌與不同地區細菌的流行性比較

導致奶牛乳房炎的病原微生物種類在不同地理區域內各不相同，天津某牧場流行的細菌與其他地區可能不同。在山東省不同地區的病原微生物檢出率不同，青島市Sta.aureus檢出率最高(50.0%)，東營市E.coli檢出率最高(40.0%)，日照市乳房鏈球菌(Str.ubers)檢出率最高(31.25%)[25]。從遼寧西部5個城市的乳房炎奶樣中分離鑒定得到的主要致病菌為Sta.aureus，E.coli和Str.agalactiae[26]。內蒙古巴彥淖爾地區4個不同的奶牛場共采集了80頭乳房炎患病奶牛的牛奶樣本，分離并鑒定了31種Staphylococcus，6種Streptococcus和14種Enterobacter[27]?？偠灾琒ta.aureus、Str.agalactiae、E.coli、Str.dysgalactiae和Str.ubers分別是甘肅等9省市，廣東等3省區，遼寧和上海，江蘇和湖北，新疆和廣西的優勢種群[28]。本研究從天津某牧場乳房炎奶樣中分離鑒定得到Staphylococcus，E.coli，未檢測到S.aureus，未分離鑒定出其他乳房炎致病菌，但是在乳房炎奶樣中分離出Bacillus。而且環境樣品中分離鑒定得到大量Bacillus，尤其在奶廳的前藥浴液、前藥浴杯、乳頭皮膚拭子和奶杯拭子樣品中分離出B.licheniformis，B.firmus，B.subtilis和B.cereus，畜舍樣品還分離出Enterobacter，因此，應該加強對該牧場奶廳的衛生管理與設備清洗工作，對該牧場或該地區乳房炎防治以及牧場消毒管理提供了依據。

本研究分離鑒定得到少數的Stenotrophomonas、Halobacillus、Pantoea、Oceanimonas和Ornithinibacillus等細菌，這些細菌大部分來自大自然水、土壤、植物等環境中，對人類和動物屬于條件致病菌，能夠引起人類疾病與動物傷口感染等。微病毒科細菌的7個原病毒區域稱為BMV1-7，在前藥浴液與后藥浴杯中檢測到了BMV7是其中之一。目前研究對微病毒科中噬菌體的遺傳多樣性和宿主范圍認識較少，主要有衣原體(Chlamydia)、螺旋體(Spiroplasma)和蛭弧菌(Bdellovibrio)，有研究第一次鑒定和表征了擬桿菌屬(Bacteroidetes)基因組中與微病毒科相關的前噬菌體，證明Bacteroidetes也是微病毒科細菌宿主[29]。

4 結 論

乳房炎奶樣及環境樣品中共分離鑒定出217株菌株，優勢菌群為Bacillus(146/217株，67.28%)，畜舍樣品中占比為47.87%(45/94)，奶廳樣品中占比為88.29%(98/111)。乳房炎奶樣中主要鑒定出4株Staphylococcus；畜舍樣品中共鑒定出10株Staphylococcus和8株Enterobacter，新墊料與飼料中各鑒定出1株Klebsiella；在奶廳樣品前藥浴液與后藥浴杯樣品中分離鑒定出3株細菌BMV7。因此，牧場應該進一步加強奶廳擠奶操作過程中的衛生管理，加強對奶廳設備的清洗檢查工作，減少和降低因奶牛乳頭皮膚、奶杯、藥浴液以及藥浴杯中存在的細菌而引起的乳及乳制品質量安全問題以及奶牛乳房炎致病幾率。本研究分離鑒定的單菌株，為進一步進行乳房炎致病菌的溯源工作奠定了基礎。