1.福建省腫瘤醫院，福建醫科大學附屬腫瘤醫院中心實驗室，福建 福州 350014；

2.福建省腫瘤醫院，福建醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，福建 福州 350014

較早使用具有抑制人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）功能的曲妥珠單抗，對多種HER2高表達的腫瘤有抗癌效應，聯合化療藥物一同使用可以使患者無進展生存期得到顯著延長［1-2］。然而，20多年的臨床研究［1］表明，曲妥珠單抗有效率僅為12%～34%，中位緩解期約9個月，而且許多患者在接受曲妥珠單抗治療的12個月內出現疾病進展，快速產生的耐藥性嚴重妨礙了曲妥珠單抗的抗癌療效及應用。

腫瘤上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與耐藥發生的關系是一個新的研究方向。特別是近期有若干研究［3-4］顯示，曲妥珠單抗耐藥發生過程中細胞出現EMT現象，且HER2陽性細胞發生EMT與其對曲妥珠單抗耐藥性的關系的機制研究處于起步階段。我們課題組在前期的研究［5］中發現，miR-375在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細胞株中明顯下調，并且可通過靶向胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）逆轉乳腺癌細胞株對曲妥珠單抗的耐藥性。然而，miRNA通常是在腫瘤發生的過程中通過多靶點、多信號通路發揮其作用的，miR-375是否會靶向影響EMT信號通路上的分子而發揮作用尚不清楚。因此，本研究將通過預測miR-375與EMT相關分子Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）的相互作用，分析兩者的靶向關系，初步探討miR-375通過調控EMT相關基因在乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥性中發揮的作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系、組織標本及主要試劑

HER2陽性乳腺癌細胞系SK-BR-3、人胚腎293T細胞（HEK-293T）均購自美國典型培養物保藏中心，人乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3R為空軍軍醫大學白文棟博士誘導并贈送［6］，誘導方法為HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR-3用含5 μg/mL的曲妥珠單抗及10%胎牛血清的RPMI-1640培養液壓力篩選6個月，所存活細胞即認定為耐藥細胞株。

選取2017年1—6月在福建省腫瘤醫院乳腺外科手術切除的25例乳腺癌患者腫瘤組織標本，凍存于液氮罐中。組織標本術后經病理學檢查確診為乳腺癌。所有患者均簽署知情同意書，本方案經福建省腫瘤醫院倫理委員會批準。

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、重組載體、miR-375 mimic及其對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自德國Qiagen有限公司，MTT試劑盒購自上海江林生物科技公司，蛋白抗體一抗［YAP1、波形蛋白（vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）］均購自美國CST公司，二抗（辣根過氧化物酶標記）購自武漢艾美捷科技有限公司。注射用曲妥珠單抗（440 mg/瓶）購自美國Roche公司（批號N3742），配制方法：無菌稱取曲妥珠單抗5 mg，溶解于1 mL稀釋液中，配制成5 mg/mL的母液待用，使用時用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋至5 μg/mL的工作濃度即可。

1.2 細胞培養及轉染

乳腺癌耐藥細胞株SK-BR-3R由含曲妥珠單抗（5 μg/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，SK-BR-3及HEK-293T細胞系由10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養。當細胞貼壁60%時，更換為無血清RPMI-1640培養基培養1 h，加入5 μL LipofectamineTM2000和20 nmol/L的miR-375 mimic（或NC mimic或pcDNA3.1-YAP1-MUT）。轉染6 h后更換含10%血清的RPMI-1640培養液培養48 h，進行后續實驗。

1.3 MTT實驗檢測細胞增殖能力

取各組細胞，制成細胞懸液（密度為8×104個/mL）后，接種于96孔板（200 μL/孔）上，再加入含曲妥珠單抗濃度分別為0、1、2、3、4、5 μg/mL的細胞培養液各100 μL，每個質量濃度設4個復孔。分別培養1、2、3 d后，加入0.5%MTT 4 h后，上酶標儀檢測，根據測得的吸光度（D）值繪制生長曲線。

1.4 H-E染色細胞形態學觀察

細胞爬片后，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗3次。加入95%乙醇溶液，固定20 min，PBS洗3次。加入蘇木精染液，染色2～3 min，放在自來水下，進行沖洗。使用伊紅進行浸染，1 min后，放在自來水下，進行沖洗。自然晾曬，至風干后，加入中性樹膠進行封片。顯微鏡下拍照。

1.5 平板克隆形成實驗

將各組細胞接種于6孔板（500個/孔組和2 000個/孔組）上，將以上細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養至肉眼可見的克隆為止，加入甲醇，固定15 min，用吉姆薩染色20 min，自來水沖洗并拍照。

1.6 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測miR-375及EMT相關基因的表達水平

各組細胞或組織提取RNA，紫外分光光度計檢測其純度、濃度和完整性，用反轉錄試劑盒合成cDNA，進行RTFQ-PCR檢測。miR-375正義鏈為5’-TTTGTTCG TTCGGCTCGCGTGA-3’，反義鏈為通用引物（由美國Invitrogen公司反轉錄試劑盒提供）；E-cadherin正義鏈為5’-AGTCACTGACA CCAACGATAAT-3’，反義鏈為5’-ATCGTTG TTCACTGGATTTGTG-3’；Vimentin正義鏈為5’-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3’，反義鏈為5’-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3’；YAP1正義鏈為5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGT TA-3’，反義鏈為5’-TCATGCTTAGTCCACT GTCTGT-3’；反應條件95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共38個循環。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達量。

1.7 蛋白質印跡法（Western blot）

取各組細胞，提取細胞總蛋白，取蛋白每孔上樣100 μg，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）1 h，將分離獲得的蛋白條帶電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，分別加入鼠抗人vimentin、E-cadherin、GAPDH和YAP1的一抗（體積稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃過夜。洗膜后加入羊抗鼠二抗（體積稀釋比例為1∶10 000），加入電化學發光（electrochemical luminescence，ECL）發光劑顯影，用凝膠成像儀保存圖像并分析各條帶的灰度值，以GAPDH作內參計算相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

應用生物信息學軟件TargetScan、miRDB對miR-375的靶基因進行預測，對靶基因YAP1進行分析。將miR-375 mimic和pGL3-YAP1重組載體共轉染HEK-293T細胞，分別為：miR-375 mimic與YAP1-WT、NC與YAP1-WT以及miR-375 mimic與YAP1-MUT、NC與YAP1-MUT。培養48 h后，加入PBS裂解，離心后取上清液加入白色不透明的96孔板上，避光應用雙熒光素酶檢測系統計算相對熒光素酶活性。

1.9 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理。每組實驗重復3次，計量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性采用Person相關系數描述。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-375在乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株中低表達

MTT實驗檢測顯示，在曲妥珠單抗藥物的存在下，與親本的SK-BR-3細胞系相比，耐藥株SK-BR-3R具有良好的生長特征，D值在兩種細胞株中差異有統計學意義（P＜0.01）；并且平板克隆形成實驗顯示，耐藥株SK-BR-3R具有更強的克隆形成能力（P＜0.01）。以上結果提示，SKBR-3R對曲妥珠單抗具有穩定的耐藥性，并且具有更強的增殖能力。RTFQ-PCR檢測結果顯示，與親本SK-BR-3細胞系相比，miR-375的表達水平顯著降低（P＜0.001，圖1）。

圖1 SK-BR-3R細胞株對曲妥珠單抗的藥物敏感性的變化及miR-375的低表達Fig.1 Change of trastuzumab sensitivity in SK-BR-3R cells and low-expression of miR-375

2.2 乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株發生EMT

Western blot與RTFQ-PCR實驗結果顯示，與親本SK-BR-3細胞系相比，耐藥株SK-BR-3R中EMT標志蛋白vimentin在蛋白水平和mRNA水平上的表達量均上調（P＜0.01），而E-cadherin在蛋白水平和mRNA水平上的表達量均下調（P＜0.01，圖2A、B）。而對兩種細胞株的H-E染色結果顯示，與親本細胞系相比，耐藥細胞株SK-BR-3R在細胞形態學上發生了明顯改變（圖2C）。以上結果提示，與親本細胞系相比，乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3R具備了EMT的特征。

2.3 轉染miR-375 mimic對乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株藥物敏感性的影響

對耐藥株分別轉染miR-375 mimic和NC后，分別檢測其mRNA的表達量，以及對曲妥珠單抗的耐藥性和平板克隆形成能力。與NC組比較，RTFQ-PCR檢測結果顯示，miR-375 mimic組在SK-BR-3R細胞中miR-375表達顯著升高（P＜0.001，圖3A）；MTT實驗檢測結果顯示，轉染了miR-375 mimic的耐藥細胞株在曲妥珠單抗存在的情況下，其增殖能力顯著下降（P＜0.01，圖3B）；而平板克隆形成實驗顯示，其克隆形成能力也顯著下降（P＜0.01，圖3C）。以上結果提示，與NC組相比，上調miR-375的表達量可以增加耐藥細胞株對曲妥珠單抗的藥物敏感性，并且其增殖能力受到顯著抑制。

2.4 轉染miR-375 mimic可逆轉乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT

圖2 SK-BR-3R細胞株具有EMT特征Fig.2 EMT characteristics of SK-BR-3R cells

圖3 轉染miR-375對SK-BR-3R細胞曲妥珠單抗藥物敏感性的影響Fig.3 Effect of miR-375 on trastuzumab sensitivity in SK-BR-3R cells

進一步采用Western blot對EMT標志蛋白進行檢測，與NC組比較，miR-375 mimic組的vimentin表達量明顯下調（P＜0.05），同時E-cadherin表達量明顯上調（P＜0.05，圖4A）。RTFQ-PCR實驗檢測結果顯示，在mRNA水平上，vimentin表達量明顯下調（P＜0.01），同時E-cadherin表達量明顯上調（P＜0.01，圖4B）。以上結果提示，上調miR-375的表達量可以逆轉曲妥珠單抗耐藥細胞的EMT特性。

圖4 轉染miR-375對SK-BR-3R細胞EMT 特征的影響Fig.4 Effect of miR-375 on EMT in SK-BR-3R cells

2.5 YAP1與miR-375的靶向關系

通過生物信息學軟件TargetScan、miRDB預測miR-375的靶基因，發現其與EMT相關基因YAP1的3’-UTR存在結合位點（圖5A）。熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-375 mimic與YAP1-WT共轉染組的細胞熒光信號顯著低于NC組（P＜0.01），而miR-375 mimic與YAP1-MUT共轉染組的細胞熒光信號與NC組比較差異無統計學意義（P＞0.05，圖5B）。以上結果提示，miR-375能夠特異性地與YAP1的3’-UTR發生靶向結合。

對25例乳腺癌患者組織標本通過RTFQ-PCR進行了miR-375和YAP1表達量的檢測，Person相關分析顯示，乳腺癌組織中miR-375和YAP1在mRNA水平上呈負相關（r=-0.586 8，P=0.002 6，圖5C）。

2.6 miR-375靶向YAP1對細胞藥物敏感性以及EMT特性的影響

對耐藥株進行miR-375 mimic和pcDNA3.1-YAP1-MUT共轉染，通過Western blot檢測，與miR-375 mimic組相比，在共轉染的耐藥株中，EMT標志蛋白vimentin和E-cadherin的表達均得到了恢復（P＜0.05，圖6A），并且其對曲妥珠單抗的藥物敏感性（P＜0.01，圖6B）和平板克隆形成能力也得到了恢復（P＜0.05，圖6C）。以上結果提示，miR-375是靶向YAP1來發揮作用的。

圖5 miR-375靶向下調YAP1的表達Fig.5 miR-375 down-regulated the expression of YAP1

圖6 miR-375靶向YAP1對SK-BR-3R 細胞藥物敏感性及EMT特征的影響Fig.6 Effect of miR-375 targeting YAP1 on trastuzumab sensitivity and EMT characteristics in SK-BR-3R cells

3 討 論

抗體藥物已被廣泛用于各種腫瘤治療。臨床發現，不少初始治療有效的單抗很快就會因發生耐藥而失效，導致抗癌療效不持續，復發轉移頻發，患者的5年生存率未得到改善，研究抗體藥物的耐受機制及如何使其逆轉是當前抗癌領域的重點。本研究從miRNA角度出發，探討miR-375通過靶向調控YAP1基因，促進細胞EMT特性的逆轉，進而參與調控乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的藥物敏感性。

miR-375作為一種腫瘤抑制miRNA，已被證實在多種腫瘤中表達下調，并且通過靶向許多重要癌基因如AEG-1、IGF1R和PDK1來發揮其核心抑癌特性［7-9］。在腫瘤中，miR-375的改變是由多種機制引發的，包括轉錄因子失調、啟動子異常甲基化等［10-11］，其在組織中的低表達或低循環可能提示許多惡性腫瘤較差的預后。miR-375因其在體內外抑制腫瘤生長的特性進一步為發展中的靶向治療提供了方向。本研究發現，在乳腺癌曲妥珠耐藥細胞株中，miR-375發生了明顯的下調，這與前期的miR-375與腫瘤相關的報道［7-9］一致。

EMT已知在腫瘤的發展、轉移和藥物耐受中扮演著重要角色。盡管EMT和腫瘤轉移中的因果關系存在爭議，EMT在腫瘤耐藥方面已被不斷認知，包含了在腫瘤細胞藥物耐受過程中許多EMT相關通路。發生EMT的細胞同時被證明具有腫瘤干細胞樣特征，如藥物外排和抗凋亡影響［12-14］。因此，靶向EMT已經被認為是攻克藥物耐受的一個新途徑。Wu等［4］研究發現，在HER2陽性腫瘤耐藥細胞株中伴隨有EMT樣改變并與Wnt/β-catenin信號通路激活相關，提示在曲妥珠單抗耐藥的過程中，EMT可能發揮作用。本研究結果顯示，與親本敏感細胞系相比，耐藥細胞株的間質標志蛋白vimentin水平上調，而上皮標志蛋白E-cadherin水平下調，提示乳腺癌細胞對曲妥珠單抗耐藥的同時具有EMT特性，與Wu等［4］的研究結果相一致。

YAP1作為在Hippo通路中扮演重要角色的轉錄共激活因子，已被證實是一個促腫瘤靶點［15］。作為一個致癌基因，YAP1基因的mRNA在許多腫瘤細胞內均高表達，并與腫瘤的形成有較強的相關性［16］。越來越多的研究證明，YAP1可以在體外誘導許多細胞株發生EMT［17-20］，并且成為乳腺癌轉移有力的推動者［21］。miR-375和YAP1的靶向關系在多種腫瘤中已經被報道［22-23］。本研究發現，在乳腺癌患者腫瘤組織中兩者呈負相關，且熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-375 mimic和YAP1-WT共轉染組細胞熒光信號顯著低于其他組，提示YAP1和miR-375存在靶向調控關系。在乳腺癌耐藥細胞株中分析miR-375靶向YAP1的生物學功能發現，miR-375通過靶向調控YAP1而參與曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT和藥物敏感性的變化。

綜上所述，miR-375作為一種腫瘤抑制因子，可通過靶向YAP1的表達對曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT進行調控，從而逆轉其EMT特性和藥物敏感性。從EMT角度來探討HER2陽性乳腺癌細胞耐藥的發生，有望為臨床解決曲妥珠單抗的耐藥提供新的途徑和治療靶點。