福建醫科大學附屬泉州第一醫院胸外科，福建 泉州 362000

食管癌是上消化道常見的癌癥之一，也是全球癌癥相關死亡率的第6大主要原因。食管癌患者的常規臨床治療包括手術、放療和化療［1］。盡管近年來改良了治療技術，但食管癌患者的總體5年生存率仍僅為20%～30%［2］。因此，了解食管癌發病的分子機制，對于發現更多的腫瘤特異性生物標志物和治療靶點，進行早期診斷和治療具有重要意義。miRNA是一類高度保守的、非編碼的18～25個核苷酸的RNA，在轉錄后水平上起負調控基因表達的作用［3］。miRNA依賴于其靶基因，通過影響腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、分化和代謝，既可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因。miR-122在胃癌、卵巢癌等腫瘤中發揮抑癌作用，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等［4-5］；而在腎癌、三陰性乳腺癌等多種腫瘤中發揮致癌作用，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等［6-7］；但是miR-122-5p對食管癌細胞的作用尚不清楚。已有研究［8］表明，cAMP反應元件結合蛋白1（cAMP response element-binding protein 1，CREB1）在食管鱗狀細胞癌組織中過表達，與患者的淋巴結轉移和腫瘤淋巴結轉移階段呈正相關。本文主要研究miR-122-5p通過靶向CREB1對食管癌細胞及移植瘤的生長的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養基購自上海慧穎生物科技有限公司（貨號：C21700500BT），miR-NC、pc-NC、miR122-5p mimic、pc-CREB1質粒和實驗所用各種引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，MTT試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司（貨號：GM01-500T），胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自上海素爾生物科技有限公司（貨號：16000-044、15140122），miRNeasy試劑盒購自南京新科元生物技術有限公司（貨號：217004），SYBR-Green聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司（貨號：4309155），cDNA反轉錄試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司（貨號：GK8030-20），BCA試劑盒購自上海易色醫療科技有限公司（貨號：BC201），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、Ki-67、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2、CREB1兔來源的單克隆抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司（貨號：ab36151、ab92742、ab18197、ab2302、ab32503、ab182858、ab32515），LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海恪敏生物科技有限公司（貨號：11668-027）。裸鼠購自四川夏派森醫藥科技有限公司［許可證：SYXK（川）2017-203］。Nano-Drop分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司，FluorChem HD2凝膠成像系統購自美國ProteinSimple公司。

1.1.2 細胞及培養

人正常食管細胞HEEC和食管癌細胞系（EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1）均購自上海素爾生物科技有限公司，所有細胞在含體積分數為10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。

1.1.3 組織樣品

選取2017年11月—2019年11月于福建醫科大學附屬泉州第一醫院行腫瘤瘤切除術后保存在液氮中的食管癌及相應癌旁正常組織（距癌邊緣3～5 cm）標本43例。其中男性28例，女性15例，年齡35～71歲；按照美國癌癥聯合會TNM分期，Ⅰ期3例，Ⅱ期25例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例。所有患者術前均未接受化療和放療，且經術后病理學檢查證實為原發性食管癌。該研究得到福建醫科大學附屬泉州第一醫院研究倫理委員會批準，并根據《赫爾辛基宣言》的道德準則進行，且該實驗獲得患者的同意并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測miR-122-5p和CREB1 mRNA的表達［9］

使用miRNeasy試劑盒從食管癌組織和細胞系中提取總RNA，并用Nano-Drop分光光度計測量RNA質量和濃度。用PrimeScript RT Master Mix Kit將mRNA反轉錄為cDNA，并按SYBR-Green PCR試劑盒說明擴增并檢測mRNA。miR-122-5p的循環條件：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，共35個循環，用U6標準化。CREB1的循環條件為：95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環，用U6標準化。每個樣品進行3次重復分析。使用2-ΔΔCt方法計算。miR-122-5p的上游引物序列：5’-CCGCTCGAG TTCGTGGCTACAGAGTTT-3’，下游引物序列：5’-CCGGAATTCTTTATCGAGGGAAGGAT T-3’；CREB1的上游引物序列：5’-CGCGGAT CCAAATGGACTGGCTTGG-3’，下游引物序列：5’-CGGAATTCTGCCCTATGGAAGAGC TG-3’；U6的上游引物序列：5’-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2 細胞分組及轉染

將細胞分為對照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組。取對數生長期細胞，接種于6孔板（1×106個/孔）上。當達到80%融合時，根據LipofectamineTM2000說明書將100 nmol/L的miR-NC、pc-NC、miR-122-5p mimic、pc-CREB1質粒分別或聯合轉染進入EC109細胞中。

1.2.3 雙螢光素酶報告基因實驗分析靶向關系［5］

將EC109細胞接種在24孔板上，并溫育24 h。將1 μg螢火蟲螢光素酶報告基因構建體PGL3-CREB1-WT（CREB1野生型）或PGL3-CREB1-MUT（CREB1突變型）以及miR-122-5p mimic或mimic-NC和PRL-CMV海腎螢光素酶報告質粒轉染細胞，轉染48 h后，EC109細胞裂解15 min，采用雙螢光素酶檢測系統測量螢光素酶的相對活性，用螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對活性。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖情況［9］

取1.2.2處理的細胞，將每組2 000個細胞接種在含有150 μL培養基的96孔板上。在不同的培養時間（24、48、72 h）后，向每個孔中添加20 μL MTT底物（5 mg/mL），并將板再溫育4 h。然后除去培養基，并將細胞溶解在150 μL的二甲基亞砜中。然后將培養板搖動15 min，并在490 nm處讀取吸光度（D）值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞生長能力［5］

將細胞接種于6孔板（1×106個/孔）上，直到生長至可見菌落。用甲醇溶液固定菌落，0.25%結晶紫染色30 min，計算菌落數量。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率［9］

取1.2.2處理的細胞培養24 h后，離心收集細胞，并按1×106個/mL的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光溫育15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測Ki-67、PCNA、活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2、CREB1蛋白的相對表達水平［9］

取1.2.2處理的細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗［Ki-67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、胱天蛋白酶-3 1∶500、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、CREB1 1∶1 000、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）1∶1 000］4 ℃封閉過夜，接著加入對應山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學反應液曝光，以GAPDH為內參，使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度，以目標蛋白與內參蛋白GAPDH積分光密度（integrated-optical density，IOD）比值表示蛋白的表達水平。

1.2.8 裸小鼠移植瘤實驗［10］

所有BALB/c裸小鼠分為4組：control組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組。在裸小鼠左腋下皮下注射各轉染過的EC109細胞（每只裸小鼠在100 mL PBS中注射5×106個細胞），繼續在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下正常飲食飼養。第30天頸椎脫位法處死裸小鼠，完整取出皮下腫瘤，測定移植瘤體積和質量，采用免疫組織化學法檢測Ki-67標記指數和胱天蛋白酶-3的表達水平。

1.2.9 免疫組織化學法檢測Ki-67標記指數和胱天蛋白酶-3的表達水平［11］

移植瘤經常規石蠟包埋切片，脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應，分別加入兔來源Ki-67和活化胱天蛋白酶-3單克隆抗體，4 ℃過夜，滴加生物素標記二抗，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察統計。Ki-67陽性染色多數位于細胞核中，胱天蛋白酶-3陽性染色多數位于細胞質中。每組選取5張片子，每張片子在×200光學顯微鏡下隨機選取3個視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67標記指數和胱天蛋白酶-3在樣本中的IOD值，用IOD值反映免疫反應物的表達強度。

1.3 統計學處理

所有統計數據采用SPSS 22.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0軟件構建。實驗數據以x±s表示，數據經Shapiro-Wilk檢驗發現均呈正態分布，多組比較進行One-Way ANOVA分析，兩組比較使用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-122-5p和CREB1在食管癌組織和細胞中的表達情況

與正常組織相比，食管癌組織miR-122-5p表達顯著下調（0.36±0.09vs1.00±0.04，P＜0.0 1），CREB1mRNA表達顯著上調（3.62±0.08vs1.01±0.05，P＜0.01，圖1A）；食管癌組織中miR-122-5p與CREB1表達呈負相關（r=0.897 7，圖1B）。人正常食管細胞HEEC及食管癌細胞系EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1中miR-122-5p表達分別是1.00±0.05、0.34±0.08、0.3 1±0.0 9、0.3 6±0.0 7、0.3 9±0.0 8、0.41±0.07、0.43±0.08，CREB1 mRNA表達分別是1.00±0.04、4.32±0.09、4.53±0.07、4.1 6±0.0 8、3.7 2±0.0 9、3.4 3±0.0 9、3.17±0.07。與人正常食管細胞HEEC相比，食管癌細胞系EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1中miR-122-5p表達顯著下調，CREB1 mRNA表達顯著上調（P＜0.01，圖1C）；選取EC109細胞做后續實驗。

圖1 miR-122-5p和CREB1在食管癌組織和細胞中的表達情況Fig.1 miR-122-5p and CREB1 expressions in esophageal cancer tissues and cells

2.2 miR-122-5p和CREB1靶向關系

通過TargetScan軟件預測發現，miR-122-5p與CREB1的3’UTR區存在結合位點（圖2A）；通過雙螢光素酶報告基因試驗發現，miR-122-5p mimic與PGL3-CREB1-WT共轉染致螢光素酶活性顯著降低（0.42±0.06vs1.00±0.05，P＜0.01，圖2B）。與對照組相比，miR-NC組miR-122-5p水平無明顯變化（1.01±0.21vs1.00±0.20，P＜0.01），miR-122-5p mimic組miR-122-5p水平顯著上調（5.21±0.31vs1.00±0.20，P＜0.01，圖2C），說明轉染成功。與對照組相比，miR-NC和pc-NC組CREB1蛋白表達無明顯變化（0.83±0.07vs0.82±0.08，0.81±0.09vs0.82±0.08），miR-122-5p mimic組CREB1蛋白表達顯著下調（0.43±0.06vs0.82±0.08，P＜0.01），pc-CREB1組CREB1蛋白表達顯著上調（1.42±0.09vs0.82±0.08，P＜0.01，圖2D）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組CREB1蛋白表達顯著上調（0.83±0.07vs0.43±0.06，P＜0.01，圖2D）；說明轉染成功，且miR-122-5p靶向下調CREB1的表達。

2.3 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109細胞增殖的影響

對照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組24 hD值分別是0.49±0.04、0.48±0.03、0.50±0.03、0.40±0.03、0.66±0.03、0.52±0.03，48 hD值分別是0.82±0.03、0.81±0.04、0.84±0.04、0.65±0.04、1.32±0.05、0.90±0.04，72 hD值分別是1.31±0.04、1.30±0.03、1.35±0.03、0.91±0.03、2.12±0.04、1.51±0.04，克隆細胞數目分別是86.52±5.42、87.34±5.31、85.26±5.29、36.98±3.27、127.55±6.05、86.29±5.34，PCNA蛋白表達水平分別是0.42±0.03、0.43±0.04、0.41±0.03、0.19±0.04、0.72±0.04、0.43±0.04，Ki-67標記指數分別是0.53±0.04、0.54±0.03、0.52±0.04、0.23±0.03、0.81±0.04、0.55±0.05。與對照組相比，miR-NC和pc-NC組食管癌EC109細胞D值、克隆細胞數目、PCNA和Ki-67標記指數均無明顯影響，miR-122-5p mimic組食管癌EC109細胞D值和克隆細胞數目顯著減少，PCNA和Ki-67標記指數顯著降低（P＜0.01，圖3），pc-CREB1組食管癌EC109細胞D值和克隆細胞數目顯著增加，PCNA和Ki-67標記指數顯著升高（P＜0.01，圖3）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109細胞D值和克隆細胞數目顯著增加，PCNA和Ki-67標記指數顯著升高（P＜0.01，圖3）。

2.4 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109細胞凋亡的影響

對照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組細胞凋亡率分別是（4.92±0.52）%、（4.8 6±0.5 3）%、（4.9 8±0.5 5）%、（3 2.1 5±0.6 1）%、（1.1 6±0.3 2）%、（5.02±0.53）%，活化胱天蛋白酶-3表達水平分別是0.18±0.03、0.18±0.02、0.17±0.02、0.53±0.04、0.07±0.03、0.17±0.03，Bax表達水平分別是0.15±0.04、0.16±0.03、0.15±0.02、0.63±0.04、0.06±0.03、0.12±0.03，Bcl-2表達水平分別是0.55±0.04、0.56±0.03、0.54±0.03、0.21±0.03、0.72±0.04、0.55±0.04。與對照組相比，miR-NC和pc-NC組食管癌EC109細胞凋亡率和活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2蛋白表達均無明顯影響，miR-122-5p mimic組食管癌EC109細胞凋亡率顯著升高，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達顯著上調，Bcl-2蛋白表達顯著下調（P＜0.01，圖4），pc-CREB1組食管癌EC109細胞凋亡率顯著降低，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達顯著上調（P＜0.01，圖4）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109細胞凋亡率顯著降低，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達顯著上調（P＜0.01，圖4）。

圖2 miR-122-5p和CREB1靶向關系Fig.2 miR-122-5p and CREB1 targeting relationship

圖3 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109細胞增殖的影響Fig.3 The effect of miR-122-5p on the proliferation of esophageal cancer EC109 cells by targeting CREB1

圖4 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of miR-122-5p on apoptosis of esophageal cancer EC109 cells by targeting CREB1

2.5 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109移植瘤生長的影響

對照組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積分別是（833.46±22.95）、（397.52±20.56）、（1286.43±26.42）、（856.99±22.75）mm3，移植瘤質量分別是（0.83±0.05）、（0.39±0.04）、（1.21±0.05）、（0.85±0.04）g，Ki-67的IOD值分別是162.49±23.55、89.53±22.73、281.46±27.18、172.44±25.64，活化胱天蛋白酶-3的IOD值分別是97.33±25.37、186.92±28.12、48.73±24.55、104.52±26.16。與對照組相比，miR-122-5p mimic組食管癌EC109移植瘤體積顯著減小，質量顯著減輕，Ki-67標記指數顯著升高，胱天蛋白酶-3表達顯著減少（P＜0.01，圖5），pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積顯著增大，質量顯著增加，Ki-67標記指數顯著降低，活化胱天蛋白酶-3表達顯著增加（P＜0.01，圖5）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積顯著增大，質量顯著增加，Ki-67標記指數顯著降低，胱天蛋白酶-3表達顯著增加（P＜0.01，圖5）。

圖5 miR-122-5p靶向CREB1對食管癌EC109移植瘤生長的影響Fig.5 The effect of miR-122-5p on the growth of esophageal cancer EC109 xenografts by targeting CREB1

3 討 論

越來越多的證據顯示，miRNA在腫瘤的發展和轉移中發揮關鍵作用。miRNA充當基因表達的主要調節劑，在食管癌中存在大量miRNA的異常表達，如miR-574-3p在食管癌中低表達，作為抑癌基因［12］；miR-424在食管癌中高表達，作為致癌基因［13］。已有研究［14］表明，miR-122-5p既可以作為致癌基因，如miR-122通過體外靶向ALDOA促進結腸癌的發展，又可以作為抑癌基因，如miR-122-5p通過靶向ALDOA抑制膽管癌細胞的增殖、侵襲和生長［15］。同已有研究［16］結論相一致，本研究表明，miR-122-5p在食管癌組織和細胞中低表達。此外，本研究還發現，過表達miR-122-5p減少食管癌細胞克隆數目，下調PCNA和Ki-67標記指數，增加細胞凋亡率，上調活化胱天蛋白酶-3和Bax蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達。腫瘤的一大特征就是細胞的無限生長。在正常情況下，細胞的增殖和凋亡處于一種動態平衡，但是在腫瘤細胞中細胞可無限增殖，而細胞凋亡被抑制［17］。PCNA和Ki-67標記指數反映細胞增殖能力［18］。Caspase家族和Bcl-2家族在細胞凋亡轉導通路尤其是線粒體途徑中發揮極為重要的調控作用，其中活化胱天蛋白酶-3、Bax和Bcl-2是常見的細胞凋亡標志蛋白，反映細胞的凋亡能力［19］。這說明過表達miR-122-5p抑制食管癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡。

本研究結果顯示，miR-122-5p對食管癌細胞的作用是通過靶向下調CREB1表達來實現的。CREB1基因位于人類染色體2q32.3-q34處，屬于堿性/亮氨酸拉鏈轉錄因子家族［20］。CREB1基因編碼多效性轉錄因子，在癌癥中經常失調，可以調節腫瘤細胞的增殖或遷移狀態［21］。CREB1在胃癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌等多種癌癥中表達上調，作為癌基因，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進腫瘤的發展［22］。已有研究［8］表明，CREB1在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，同本研究結果相一致。本研究結果顯示，CREB1過表達增加食管癌細胞克隆數目，上調PCNA和Ki-67標記指數，減少細胞凋亡率，下調活化胱天蛋白酶-3和Bax蛋白表達，上調調Bcl-2蛋白表達，提示CREB1過表達誘導食管癌細胞增殖，并抑制細胞凋亡。同時本研究還發現，同時過表達miR-122-5p和CREB1可逆轉miR-122-5p過表達對食管癌細胞增殖的抑制作用及凋亡的誘導作用，提示miR-122-5p過表達對食管癌細胞增殖的抑制作用及凋亡的誘導作用是通過下調CREB1表達來實現的。與miR-506通過靶向CREB1抑制食管癌細胞增殖的研究［23］結果相似，本研究證明，miR-122-5p通過靶向CREB1抑制食管癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡。同體外研究結果相一致，體內移植瘤實驗結果表明，miR-122-5p靶向CREB1減小食管癌EC109移植瘤體積和質量，增加Ki-67陽性細胞比率，減少胱天蛋白酶-3陽性細胞比率，證明miR-122-5p通過靶向CREB1抑制食管癌移植瘤的生長。

綜上所述，miR-122-5p通過靶向下調CREB1來抑制食管癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡，從而抑制食管癌細胞和移植瘤的生長，提示miR-122-5p和CREB1可成為治療和預防食管癌的潛在靶點。