基于HS-SPME-GC-MS的4種不同蝴蝶蘭種質資源花朵揮發性成分比較分析

肖文芳 李 佐 陳和明 呂復兵

(廣東省農業科學院 環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣州 510640)

花香是觀賞作物最重要的品質之一。迄今為止，已從1 000余種花卉中鑒定出1 700多種揮發性物質，主要分為萜類化合物、苯丙酸類化合物/苯環型化合物和脂肪酸衍生物三大類，其中萜類化合物是最主要也是最多元化的組分[1]。研究發現，蘭科植物花香揮發性成分主要為萜類化合物，但不同種屬之間種類和含量均存在較大差異，甚至同一個種的不同品種之間差異也較大。鼓槌石斛的主要香氣成分為乙酸辛酯、β-羅勒烯、α-蒎烯和苯乙醛[2]，而流蘇石斛的主要香氣成分則為α-蒎烯(45.06%)和β-蒎烯(23.22%)[3]；國蘭中，蕙蘭鮮花的主要香氣成分為桉油精(14.49%)和(E)-4-己基葵烯-6-炔(8.97%)，墨蘭鮮花的主要香氣成分為甲基-異丁子香酚(17.70%)和6-氧代庚酸甲酯(14.16%)，春蘭鮮花的主要香氣成分則為α-芹子烯(30.05%)和十二烷(14.75%)[4]；具巧克力香味的文心蘭‘Sharry Baby’的主要香氣成分為3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(61.58%)[5]，而具芳香味的‘Rosy Sunset’這一品種的主要香氣成分為沉香醇(52.80%)和苯甲醛(9.25%)[6]；雜種卡特蘭‘3G’的主要香氣成分為3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(30.15%)、3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(16.63%)和壬烷(12.77%)[7]。

蝴蝶蘭(Phalaenopsis)，原產于亞洲熱帶地區至澳大利亞，分4個亞屬共70多個原生種，其中接近一半具花香[8]。蝴蝶蘭商品品種為優選的原生種雜交后代，長達200年的雜交育種過程中育種家一直過于追求花朵數和花朵大小等性狀，導致目前市場流行品種基本不具備花香這一優良觀賞性狀。隨著市場需求的變化和發展，香花品種的選育已成為急需突破的瓶頸之一。目前對蝴蝶蘭花朵揮發性成分的研究極少且只集中在原生種上，Hsiao等[9]發現濃香型的熒光蝴蝶蘭(Phal.bellina)和大葉蝴蝶蘭(Phal.violacea)中花朵揮發性成分主要為芳樟醇、香葉醇及其衍生物，Awano等[10]發現淡香型的西蕾麗蝴蝶蘭(Phal.schilleriana)中主要揮發性成分為乙酸橙花酯、橙花醇、香茅醇及乙酸香茅酯，而嗅感無香的小蘭嶼蝴蝶蘭(Phal.equestris)的揮發物主要為2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol、2-乙基己醇和2-己醇[11]。但針對個別種質資源的分散研究不足以說明蝴蝶蘭花朵揮發性成分的一般規律和主要特征，特別是在缺乏對商品品種的研究和分析的情況下，目前急需對不同種質資源，包括原生種和商品品種進行交叉比較，分析嗅感具花香與不具花香種質資源花朵揮發性成分的差異，篩選蝴蝶蘭花朵主要致香成分，為香花品種的選育提供理論支撐。

HS-SPME-GC-MS技術是目前廣泛應用的蘭花花朵揮發性成分鑒定方法[3-11]。本研究以4個不同蝴蝶蘭種質資源為試驗材料，包括1個原生種、1個原生種間的雜交種和2個商品品種，其中2個種質資源具花香，2個不具花香，采用HS-SPME-GC-MS技術檢測其花朵揮發性成分并進行定性及定量分析，通過香氣強度值和香氣品質分類對不同種質資源進行香氣特征分析，構建具花香與不具花香蝴蝶蘭種質資源花朵揮發性成分對比數據庫，尋找影響嗅感的主要致香成分，以期為蝴蝶蘭香花品種的選育提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗅感不具花香的蝴蝶蘭種質資源2個：N1(Phal. Frigdaas Yellow Koer，廣東省農業科學院環境園藝研究所自主選育新品種)和N2(Phal. Sogo Vivien，市場流行商品品種)，嗅感具濃郁花香的種質資源2個：F1 [(Phal.javanica×Phal.hieroglyphica)×Phal.violacea，原生種雜交后代]和F2(Phal.bellinah.f. coerulea，原生種)(圖1)。4個蝴蝶蘭種質資源均栽培保存于廣東省農業科學院環境園藝研究所白云基地蘭花資源圃中。2018年12月花期時，在晴朗的上午10:00采集盛開第5天的花朵[11]，液氮速凍15 min后放入超低溫冰箱備用。

(a)嗅感不具花香蝴蝶蘭種質資源N1；(b)嗅感不具花香蝴蝶蘭種質資源N2；(c)嗅感具花香蝴蝶蘭種質資源F1；(d)嗅感具花香蝴蝶蘭種質資源F2

1.2 試驗方法

1.2.1頂空固相微萃取

取處理好的冷凍樣品，研磨均勻后取0.5 g放入連接萃取頭(Sigma-Aldrich, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex/SS, 2 cm)的20 mL頂空瓶中，再加入10 μL 2-辛醇(10 mg/L，溶于水中)為內標，60 ℃預熱15 min，萃取30 min后，上GC-MS測定。

1.2.2GC-MS分析條件

儀器為Agilent 7890B GC-5977B MS，色譜柱為Agilent的DB-Wax(30 m×250 μm×0.25 μm)。不分流模式進樣，以氦氣為載氣，隔墊吹掃流速為3 mL/min，柱流速為1 mL/min。初始溫度40 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min。前進樣口溫度、傳輸線溫度、離子源溫度和四級桿溫度分別為250、250、230和150 ℃，電離電壓設定為-70 eV。以掃描方式獲得質譜數據，質譜檢測范圍為20～500 m/z，溶劑延遲時間為0 min。

1.3 數據分析

使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)和NIST庫對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊和質譜匹配等分析[12]。

通過峰面積進行歸一化定量[13]，其中相對含量為組分峰面積與總峰面積之比。

組分揮發物含量按內標法計算如下[14]：

(1)

式中：Wx為某組分含量，mg/kg；Ax為某組分揮發物的峰面積；nis為內標物物質的量，mol；Mx為某組分摩爾質量，g/mol；Ais為內標物的峰面積，m0為樣品取樣量，kg。

香氣強度值(Odor-activity values, OAVs)的計算公式如下[14]：

(2)

式中：Tx為某組分揮發物根據文獻查詢得到的香氣閾值，mg/kg。

2 結果與分析

2.1 4個不同蝴蝶蘭種質資源花朵揮發性成分類型及含量

采用HS-SPME-GC-MS測定4個不同蝴蝶蘭種質資源花朵的揮發性成分，根據總離子流色譜圖、ChromaTOF軟件和NIST庫質譜匹配結果對檢出峰進行鑒定。通過峰面積進行歸一化對揮發物含量進行相對定量，通過內標法計算揮發物含量。

4個不同蝴蝶蘭種質資源累計共檢出365個物質，其中F1中鑒定出279個物質，F2中277個物質，N1中224個物質，N2中285個物質。4個不同種質資源中共同檢出的物質120個，只在3個中檢出的物質98個，只在2個中檢出的物質147個，沒有僅在1個中檢出的物質。根據相對峰面積含量逆序排列，取每個種質資源累計含量超過90%且相似度高于700的物質，共46個(表1)進行揮發性成分特征分析，其中2-正戊基呋喃在兩個不同的保留時間中均鑒定出，可能為同分異構體。46個揮發性成分分為單萜類、醛類、醇類、酮類、呋喃、酯類和肟7大類，其中醛類化合物種類最多，為16種，其次為單萜類化合物11種，醇類化合物10種，酮類3種，呋喃3種，酯類2種，肟1種(圖2)。

表1 4個不同蝴蝶蘭種質資源的花朵主要揮發性物質比較Table 1 Comparison of main volatile compounds in flowers of four different Phalaenopsis germplasms

表1(續)

表1(續)

圖2 4個不同蝴蝶蘭種質資源的花朵揮發物類型

4個不同種質資源中共同檢出且相對含量占比最高的揮發物為青葉醛、黃瓜醛和己醛，在F1、N1和N2中的累加相對含量均超過了35.000 0%，在F2中的累加相對含量也達到了15.053 1%。由此可見，青葉醛、黃瓜醛和己醛可能是蝴蝶蘭花朵的基礎性揮發物，雖然不同種質資源中的揮發含量可能不同，但在總揮發物中的占比一般都較高。

2.2 4個不同蝴蝶蘭種質資源花朵揮發性成分差異比較

4個種質資源根據嗅感分為香花組和無香組，其中香花組的特有檢出物51個，含量最高的為芳樟醇單氧化合物(F1: 0.120 7 mg/kg，F2: 0.036 8 mg/kg)，無香組的特有檢出物32個，含量最高的為反-2-己烯-4-氧代-醛(N1: 0.012 8 mg/kg，N2: 0.009 4 mg/kg)。

香花組樣品F1的花朵揮發物主要為單萜類化合物芳樟醇(1.204 9 mg/kg)、醛類化合物黃瓜醛(0.654 5 mg/kg)和青葉醛(0.318 8 mg/kg)；F2的花朵揮發物主要為單萜類化合物香葉醇(0.518 0 mg/kg)、醛類化合物黃瓜醛(0.188 4 mg/kg)和醇類化合物乙酸二萘酯(0.138 5 mg/kg)。可見，香花組蝴蝶蘭的花朵揮發性成分主要為單萜類、醛類和醇類化合物，但不同種質資源的揮發性成分種類及含量并不相同，具有特異性。

無香組樣品N1的花朵揮發物主要為醛類化合物青葉醛(0.219 0 mg/kg)、己醛(0.159 4 mg/kg)、黃瓜醛(0.078 1 mg/kg)和酮類化合物乙烯基乙基酮(0.076 1 mg/kg)；N2的花朵揮發物主要為醛類化合物青葉醛(0.365 5 mg/kg)、己醛(0.250 0 mg/kg)、黃瓜醛(0.232 3 mg/kg)和酮類化合物乙烯基乙基酮(0.180 2 mg/kg)。雖然含量排名前4的揮發物在2個不同樣品中種類相同而含量不同，但是后續排名相同的揮發物種類和含量則均不同，如樣品N1花朵揮發物含量排名第5高的物質為單萜類化合物(E)-β-羅勒烯(0.033 6 mg/kg)，而樣品N2花朵揮發物含量排名第5高的物質為醇類化合物己醇(0.159 9 mg/kg)。可見，無香組蝴蝶蘭的花朵揮發性成分主要為醛類化合物和酮類化合物，但不同種質資源的揮發性成分種類及含量并不完全相同，具有特異性。

2.3 4個不同蝴蝶蘭種質資源花朵主要揮發性成分香氣強度與品質

OAVs為某一組分揮發物的含量與其香氣閾值的比值，是衡量揮發性物質對香氣貢獻度的一個重要指標，揮發物的OAVs越大，對香氣的貢獻也就越大[14]。本實驗對4個不同蝴蝶蘭種質資源定性和定量分析了其花朵的45種主要揮發性物質(表1)，由于反-2-己烯-4-氧代-醛、2,2-二甲基-3-庚酮、4-氧-2-己烯醛、5-乙基環戊烯-1-乙醛和甲氧基苯肟未見香氣閾值和香氣特征報道，不能進行香氣強度值計算和香氣特征分析，試驗對其余40種主要揮發物的香氣強度值進行計算，其中2-正戊基呋喃的香氣強度值計算中組分含量采用2個不同保留時間的含量相加。40種主要揮發物中甲醇為酒精味沒有香氣類型，順-2-庚醛未見香氣特征報道，對38種主要揮發物的香氣特征進行分析[15]，發現蝴蝶蘭花朵揮發性成分的香氣類型主要為花香、青香、脂香、果香、辛香、蠟香、草藥香、柑橘香和其他少數香型(木香、化學香、發酵香、土石型、醚香型和薄荷香型等)(表2和圖3)。

表2 4個不同蝴蝶蘭種質資源花朵主要揮發性成分香氣強度與品質

表2(續)

表2(續)

圖3 4個不同蝴蝶蘭種質資源香氣類型分布

在香花組的2個樣品中，F1中OAVs大于1的物質有15個，F2中有12個，2個樣品中OAVs最高的揮發物均為花香型的芳樟醇(F1: 5 476.997 6，F2: 470.599 7)，其次為青香型的黃瓜醛(F1: 818.175 8，F2: 235.555 9)和脂香型的反式-2-壬烯醛(F1: 328.791 2，F2: 398.975 4)，芳樟醇、香葉醇、黃瓜醛、反式-2-壬烯醛、乙酸二萘酯、2-正戊基呋喃和順式-3-壬醇這7種成分對嗅感具花香蝴蝶蘭花朵的氣味構成具有主要作用。實際嗅感上，芳樟醇為濃青帶甜的木青氣息，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香和果香氣息，香葉醇的嗅感與芳樟醇類似，黃瓜醛、反式-2-壬烯醛和乙酸二萘酯為青香，2-正戊基呋喃具果香，順式-3-壬醇具蠟香。F1與F2實際嗅感均為花香摻雜青香，且F1花香較F2濃烈，與測量分析結果顯示的嗅感一致。在無香組的2個樣品中，N1中OAVs大于1的物質有11個，N2中有14個，2個樣本中OAVs最高的均為脂香型的反式-2-壬烯醛(N1: 131.422 6，N2: 376.477 6)，其次為青香型的黃瓜醛(N1: 97.633 8，N2: 290.383 5)和柑橘香型的環氧-2-癸醛(N1: 20.014 7，N2: 174.609 4)，反式-2-壬烯醛、黃瓜醛、環氧-2-癸醛和順式-4-庚醛這4種成分對嗅感不具花香蝴蝶蘭花朵的氣味構成具有主要作用。實際嗅感上，反式-2-壬烯醛、黃瓜醛和順式-4-庚醛均為青香，環氧-2-癸醛為柑橘香，N1與N2實際嗅感均為青香，與測量分析結果顯示的嗅感基本一致。通過OAVs加和值進行香氣系列分布分析發現，嗅感具花香蝴蝶蘭中花香型揮發物占比最重，青香型和脂香型所占比重接近，不同種質資源具特異性，是嗅感具花香蝴蝶蘭的主要香氣特征；嗅感不具花香蝴蝶蘭中青香型物質和脂香型物質占比最重，不同種質資源具特異性，是嗅感不具花香蝴蝶蘭的主要香氣特征。測量分析結果與實際嗅感基本一致，說明測量分析結果準確可信，部分物質的香氣未能被嗅覺感知，如N1和N2中具柑橘香氣的環氧-2-癸醛，可能源于人的嗅感較弱。

綜合比較發現，嗅感具花香的蝴蝶蘭種質資源與嗅感不具花香的蝴蝶蘭種質資源花朵的香氣特征區別主要來自于花香型揮發物芳樟醇和香葉醇含量的差異。嗅感具花香的蝴蝶蘭花朵揮發物主要為花香型的芳樟醇和香葉醇，導致花朵嗅感為花香；嗅感不具花香的蝴蝶蘭花朵揮發物主要為脂香型的反式-2-壬烯醛和青香型的黃瓜醛(嗅感均為黃瓜香氣)，導致花朵嗅感為類似黃瓜的青香。芳樟醇和香葉醇是蝴蝶蘭花朵的主要致香成分，其含量的多少決定蝴蝶蘭花朵的嗅感是否具花香。

3 討 論

蝴蝶蘭是商品化程度最高的蘭科植物，種質資源豐富，原生種中既有具濃郁花香的種，也有不具花香的種，而商品品種則基本不具花香[8]。前人對蝴蝶蘭花朵揮發性成分的研究較少，只針對2個濃香型蝴蝶蘭原生種、1個淡香型原生種和1個無香型原生種資源進行過花朵揮發性物質的分析[8-11]。本研究針對蝴蝶蘭具花香種質資源和不具花香種質資源，包括了原生種及商品品種，進行交叉對比，在4個不同蝴蝶蘭種質資源中共檢測到365個揮發性物質，每個樣本中檢測到的揮發性物質都超過220種，數量明顯高于前人研究中的10～50種[8-11]。對比相同樣品熒光蝴蝶蘭已有研究結果發現[10]，在相同取樣時間取樣測定(開花后第5天的晴朗早上)，花朵揮發性成分整體特征較為一致，但總揮發物含量、揮發物種類及含量上存在一定的差異；對比不同樣品但同樣表現為嗅感不具花香的種質資源的研究結果發現，在相同取樣時間取樣測定，原生種小蘭嶼蝴蝶蘭的花朵揮發物主要為2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol、2-乙基己醇和2-己醇[11]，本研究中的2個不同蝴蝶蘭種質資源的花朵揮發物均主要為青葉醛、己醛、黃瓜醛和乙烯基乙基酮。本研究結果與前人研究結果出現差異的可能原因有3方面：一是前人研究所采取的萃取條件不夠優化和精度較低，只能檢測到部分含量高或所用萃取柱吸附性好的化合物，而本研究采用更先進的檢測儀器、吸附能力更強吸附范圍更廣的色譜柱和更優質的數據分析軟件，能夠更全面地反應出檢測樣品的揮發性成分特征；二是種質資源的差異，本研究發現蝴蝶蘭不同種質資源花朵揮發性成分具特異性，與前人研究結果一致[8-11]；三是栽培環境的變化，Chuang等[39]發現蝴蝶蘭花朵揮發性物質的釋放受晝夜節律和光照的影響。

本研究通過蝴蝶蘭具花香種質資源與不具花香種質資源的對比，確定了蝴蝶蘭花朵主要致香成分為芳樟醇與香葉醇，與前人研究發現濃香型蝴蝶蘭花朵揮發性成分主要為芳樟醇、香葉醇及其衍生物[9,11]基本一致。但本研究在嗅感不具花香的2個蝴蝶蘭種質資源中均檢測到微量的芳樟醇和香葉醇，說明嗅感不具花香的蝴蝶蘭中也存在致香成分的合成及揮發，只是含量極低不能被人的嗅覺感知。前人只對1個嗅感不具花香的蝴蝶蘭種質資源進行過花朵揮發性成分的研究，且檢測精度較低，未檢測到致香成分芳樟醇和香葉醇。本研究檢測精度較高，且同時在2個不同的無香種質資源中均得出相同的檢測結果，可信度更高。后續將對更多不同的蝴蝶蘭種質資源進行檢測，進一步驗證本研究結果。

香花優良品種選育是目前蝴蝶蘭育種工作的重點和難點之一。前人研究未在無香蝴蝶蘭種質資源中發現芳樟醇和香葉醇等致香成分的揮發，認為無香蝴蝶蘭種質資源中不存在致香成分的合成路徑，導致針對無香種質資源的遺傳改良一直停留在傳統雜交育種上。但傳統育種手段選育香花新品種存在極大的阻礙[40]：一是蝴蝶蘭雜交育種周期較長，從親本雜交到子代開花需3～4年，優良單株選擇和克隆又需3年左右；二是具濃郁花香的種質資源熒光蝴蝶蘭(Phal.bellina)、紅脈蝴蝶蘭(Phal.venosa)和虎紋蝴蝶蘭(Phal.amboinensis)等的染色體為大型染色體，而作為市場主流商品品種常用育種親本的臺灣白花蝴蝶蘭(Phal.aphrodite)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phal.equestris)和淡香型的西蕾麗蝴蝶蘭(Phal.schilleriana)等的染色體則為小型染色體，兩者之間雜交親和性極低；三是花香性狀與其他市場追求的觀賞性狀之間負相關。目前，基因工程被認為是突破傳統育種桎梏的最重要手段之一。前人研究發現，蝴蝶蘭花香的釋放受到晝夜節律和光照的影響，而這一調節作用依賴于單萜類化合物合成途徑中結構基因和轉錄因子的共同作用[39]，其中關鍵結構基因為花部特異表達的PbGDPS，其表達量與熒光蝴蝶蘭中單萜類物質的釋放曲線一致[41]，主要受到轉錄因子PbbHLH4[42]和啟動子區的順勢作用元件[40]等的調控。本研究發現無香種質資源中也存在致香成分的微量揮發，即致香成分的合成和運輸途徑是完整的，通過基因工程改造現有無香優良種質資源，既通過轉基因或基因編輯等手段提高無香種質資源自身內源單萜類物質合成途徑中關鍵酶基因(GDPS等)的表達量，打通下游致香成分的穩定合成與釋放，更易實現不具花香種質資源的定向遺傳改良，為選育符合市場需求的蝴蝶蘭香花新品種提供了新的思路。

4 結 論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法對具花香的蝴蝶蘭種質資源和不具花香的蝴蝶蘭種質資源花朵揮發性成分進行測定，發現不同種質資源花朵揮發性成分存在特異性，單萜類化合物芳樟醇和香葉醇是蝴蝶蘭花朵的主要致香成分，具花香蝴蝶蘭種質資源中的釋放量最高，不具花香種質資源的花朵也存在未達嗅覺閾值的微量揮發。具花香蝴蝶蘭種質資源花朵的主要香氣類型為花香型、青香型和脂香型，不具花香蝴蝶蘭種質資源中醛類化合物的釋放量最高，主要成分為青葉醛、黃瓜醛和己醛，主要香氣類型為青香型、脂香型和柑橘香型。