基于網(wǎng)絡藥理學的羌活-益智仁藥對聯(lián)合糖皮質激素治療腎病綜合征機制研究

顧浩 ，王娟，韓森，李立，趙寧，傅強，崔趙麗，丁治國，王光磊，姜淼

1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700；2.濰坊市中醫(yī)院，山東 濰坊 262699；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院東區(qū)，北京 101100

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）以腎小球濾過膜損傷導致的大量蛋白尿（尿蛋白＞3.5 g/d）、低蛋白血癥（血漿白蛋白＜30 g/L）、高脂血癥及水腫等為主要癥狀。現(xiàn)代醫(yī)學治療NS 多以糖皮質激素為首選藥物，但長期使用會引發(fā)真菌感染、器官衰竭等多種不良反應，尤其是幼兒常產(chǎn)生激素依賴性，影響患兒生長發(fā)育。

國醫(yī)大師呂仁和教授治療NS 特別是小兒NS 收效頗佳。在控制NS 急性發(fā)作期臨床癥狀、降低尿蛋白、疾病穩(wěn)定期激素減量，以及降低激素不良反應方面均有獨特療效與體會。呂老治療小兒NS 常用羌活與益智仁配伍作為君藥，隨證組方[1]。呂老認為，羌活具有促進腎上腺皮質生理功能改善的作用，對于控制NS 病情大有裨益，特別是在病情穩(wěn)定后，應用羌活（10～20 g/劑）有利于順利減少激素用量；益智仁為溫補脾腎藥，有溫脾止瀉攝涎、暖腎縮尿固精之效，能夠降低糖皮質激素所致不良反應，促進患兒智力發(fā)育，保護腎功能，在成人NS 治療中亦可應用。二藥聯(lián)用，溫脾益腎、除濕解表，可加強糖皮質激素治療作用并降低其不良反應，隨證結合扶陽、清里、潤肺、溫中等法，臨床療效甚佳。

為深入探討羌活-益智仁藥對治療NS 的作用機制，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，對二藥的活性成分、治療靶點和作用通路進行分析，構建羌活-益智仁藥理網(wǎng)絡及NS 疾病網(wǎng)絡，并將二藥治療NS 作用通路與糖皮質激素作用于NS 相關通路網(wǎng)絡進行比對分析，探討其作為糖皮質激素補充療法的藥理作用，以期為該藥對的進一步應用開發(fā)和臨床中西醫(yī)結合用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 羌活-益智仁藥對活性成分收集

在TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和TCMID（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）數(shù)據(jù)庫輸入關鍵詞“羌活”和“益智仁”，得到藥物成分信息，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 的化學成分作為羌活-益智仁藥對活性成分。

1.2 羌活-益智仁藥對和糖皮質激素靶點篩選

將篩選出的羌活-益智仁藥對活性成分輸入TCMSP 和Stitch 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de/），得到藥物活性成分作用靶點，篩選去除重復靶點后，逐一錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），檢索人類的靶點蛋白名稱（official symbol）和Uniprot ID編號。

利用 GeneCards（http://www.genecards.org/）、NCBI-gene （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ）、OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫，輸入關鍵詞“Glucocorticoid”，檢索得到糖皮質激素治療靶點。

1.3 腎病綜合征相關靶點檢索

利用GeneCards、NCBI-gene、OMIM、Malacard（https://www.malacards.org/）數(shù)據(jù)庫，輸入關鍵詞“nephroticsyndrome”，檢索得到NS 相關靶點。

1.4 腎病綜合征靶點網(wǎng)絡構建

利用String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），輸入NS靶點，選取combined_score≥0.95的高可信度關系作為疾病網(wǎng)絡的邊，構建NS疾病網(wǎng)絡，并通過Cytoscape3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）進行展示和分析。

1.5 腎病綜合征靶點網(wǎng)絡模塊分析

利用Cytoscape3.7.2 軟件中的MCODE Cluster 算法[2]，按默認參數(shù)（NodeScoreCutoff：0.2；Haircut：true；Fluff：false；K-Core：2；Max.Depth fromSeed：100）對NS靶點網(wǎng)絡進行模塊劃分，將復雜網(wǎng)絡分解為多個亞網(wǎng)絡，進而分析核心靶點組合模塊。

1.6 KEGG 通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對羌活-益智仁靶點、糖皮質激素靶點及NS靶點進行KEGG通路富集分析。利用TBtools軟件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）對三者在靶點和通路層面的異同進行比較。

2 結果

2.1 藥物活性成分

通過TCMSP 和TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索并篩選OB≥30%、DL≥0.18 的羌活-益智仁藥對活性成分共18 種，其中羌活15種、益智仁4種，谷甾醇（sitosterol）為兩藥共有成分，見表1。

2.2 藥物和疾病靶點

通過數(shù)據(jù)庫檢索并整理，得到羌活活性成分作用靶點83個，益智仁活性成分作用靶點51個，糖皮質激素治療靶點2695個，NS 相關靶點1229個。羌活-益智仁藥對與糖皮質激素的共同靶點有68個，其中26個與NS相關。

2.3 疾病靶點網(wǎng)絡

通過String 數(shù)據(jù)庫構建NS疾病靶點網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中共有320個節(jié)點、1018條邊，見圖1。該網(wǎng)絡直徑為9，網(wǎng)絡最短路徑占網(wǎng)絡所有路徑的65%，節(jié)點平均鄰居數(shù)為6.37，特征路徑長度為3.647，網(wǎng)絡中心性為0.16，網(wǎng)絡聚集系數(shù)為0.414，表明該網(wǎng)絡具有小世界特性。節(jié)點度（degree）表示與網(wǎng)絡中某一節(jié)點關聯(lián)的其他節(jié)點的數(shù)量。該網(wǎng)絡的度分布符合冪次分布特征，回歸系數(shù)為0.835。排名前15位的NS疾病靶點見圖2。

圖1 NS疾病靶點網(wǎng)絡

圖2 NS疾病靶點網(wǎng)絡核心靶點（前15位）

2.4 疾病靶點網(wǎng)絡模塊分析

利用MCODE 網(wǎng)絡模塊劃分方法，對NS疾病靶點網(wǎng)絡降維分解，得到20個核心模塊，見圖3。6個模塊未發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點。有藥物干預靶點的模塊14個，其中糖皮質激素特有的作用模塊11個，糖皮質激素和羌活-益智仁藥對共同作用靶點的模塊3個，見表2。6個羌活-益智仁藥對的靶點分別為RELA、TNF、CASP8、IL10、CXCL8和APOE。

圖3 NS疾病靶點網(wǎng)絡模塊劃分結果

2.5 羌活-益智仁藥對作用通路分析

KEGG富集得到羌活相關通路65條，益智仁相關通路26條，NS相關通路106條（P＜0.05）。羌活-益智仁藥對與NS直接相關通路33條，其中6條為羌活與益智仁的共同通路，見圖4。

2.6 羌活-益智仁藥對與糖皮質激素聯(lián)用通路分析

KEGG 富集得到羌活-益智仁藥對通路69條，糖皮質激素通路166條（P＜0.05）。羌活-益智仁藥對與糖皮質激素治療NS 作用通路網(wǎng)絡見圖5。其中與NS相關通路33條。羌活-益智仁藥對獨有作用通路7條，分別為逆行內(nèi)源性大麻素信號、ABC運輸車、脂肪的消化吸收、尼古丁成癮、阿爾茨海默病、GABA 能突觸、精氨酸和脯氨酸代謝通路，與NS不直接相關。

表2 NS疾病靶點網(wǎng)絡模塊涉及羌活-益智仁藥對和糖皮質激素靶點

圖4 羌活-益智仁藥對作用于NS相關通路分析

圖5 羌活-益智仁藥對與糖皮質激素治療NS 作用通路網(wǎng)絡

3 討論

NS 屬中醫(yī)學“水腫”范疇，小兒NS 多屬本虛標實之證，本虛即肺、脾、腎三臟正氣虧損，以腎虛為主，臨床采用滋陰、補腎、利水治法[3]。羌活通經(jīng)活絡、行氣活血止痛，配伍益智仁補腎健脾，通中有補，符合NS 本虛標實病機，祛邪扶正兼顧。呂老常以羌活-益智仁藥對作為復方君藥，聯(lián)合糖皮質激素控制NS病情發(fā)展，療效顯著且不良反應少，尤其用于病情反復、激素減量過程中復發(fā)、激素療效不佳的患兒每獲良效。呂老認為，順應人體自然規(guī)律，糖皮質激素應于每日8 點前腎上腺激素分泌水平最高時服用，激素沖擊治療效果穩(wěn)定后逐漸改為隔日服用。羌活可健脾補腎，消除尿蛋白，激活腎上腺皮質功能，從而對明顯的庫興氏綜合征有積極效果。配伍補腎健脾的益智仁，可輔助糖皮質激素的治療作用并降低其不良反應。

本研究顯示，糖皮質激素與羌活-益智仁藥對共同通路共62 條，其中作用于NS 的通路33 條，PI3K-Akt、弓形蟲病、乙肝、利什曼病、美國錐蟲病、結核、NF-κB、小細胞肺癌、TNF 和甲狀腺激素等通路在疾病治療過程中起主要作用。研究表明，REAL、TNF-α、CASP8、IL10、CXCL8 和APOE 等基因與小兒NS 的發(fā)病與復發(fā)[4-5]、足細胞損傷[6]、尿蛋白產(chǎn)生[7]、降低細胞凋亡[8]、炎癥反應[9]、調(diào)節(jié)脂代謝[10]等有關，這些因素與NS 的發(fā)生發(fā)展密切相關。PI3K-Akt、HIF-1、雌激素、小細胞肺癌等相關通路被證實可以通過延緩腎臟纖維化[11-12]、促進腎小球足細胞增殖[13-14]、緩解小細胞肺癌的C-Mip 過表達等途徑改善腎臟功能[15]。而且，抑制NF-κB/TNF-α 信號通路的表達[16]、調(diào)整甲狀腺激素水平[17]、改善阿米巴原蟲感染通路[18]、改善胰島素抵抗水平[19]均可改善慢性腎功能衰竭微炎癥狀態(tài)，減輕腎間質纖維化，從而起到減輕腎損傷的作用。因此，羌活-益智仁藥對通過作用于相關靶點并調(diào)節(jié)相關通路，可以增強糖皮質激素的治療作用，與呂仁和教授臨床經(jīng)驗相符。

糖皮質激素抵抗不僅會降低外源性糖皮質激素對疾病的治療效果，而且可使內(nèi)源性糖皮質激素無法發(fā)揮其應有效用，從而對機體造成嚴重損害，羌活-益智仁能通過多靶點、多途徑調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路，與西藥聯(lián)用可能減少糖皮質激素抵抗作用[20]。此外，糖皮質激素可誘導脂質成分進入股骨頭并沉積在脂肪細胞和骨細胞中，導致股骨頭壞死，羌活-益智仁能夠調(diào)節(jié)脂肪的消化吸收通路，有助于防止脂質成分沉積[21]。肝細胞色素P450-3A 酶可減少股骨頭壞死面積[22]，羌活-益智仁可直接作用于細胞色素P450通路，對降低糖皮質激素誘導的股骨頭壞死有重要意義。

通過NS 疾病網(wǎng)絡模塊化分析，發(fā)現(xiàn)羌活-益智仁作用于3 個重要的NS 疾病模塊，糖皮質激素覆蓋了14 個模塊，兩者聯(lián)用，涉及疾病模塊總數(shù)的70%。模塊1 中，僅有1 個靶點SERPINF2 無藥物作用。該靶點主要與肝臟纖維化有關，能治療α-2-antiplasmin缺乏癥[23]，推測可作為NS 藥物潛在靶點。模塊4 中，僅1 個靶點HRAS 沒有藥物作用。HRAS 基因突變與Ras/MAPK 信號通路有關[24]，而Ras/MAPK 通路與NS 治療密切相關[25-26]，提示HRAS 可能是NS 疾病治療靶點，尚需進一步研究和論證。通過核心靶點模塊研究，可為潛在疾病靶點發(fā)現(xiàn)和藥物組合設計提供一定依據(jù)和思路。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學對羌活-益智仁藥對聯(lián)合糖皮質激素治療NS 的增效減毒機制進行了解析，研究結果尚需設計嚴謹?shù)脑囼灱右则炞C。在不斷積累基礎研究數(shù)據(jù)的同時，結合名老中醫(yī)的寶貴經(jīng)驗，可為臨床新藥研發(fā)提供方向和依據(jù)。