種植體表面液相沉積法構建聚多巴@氯己定抗菌涂層

殷保藏，李向陽,3，王銀龍

（1.安徽醫科大學口腔醫學院，安徽 合肥，230022；2.安徽醫科大學附屬口腔醫院，安徽 合肥，230032；3.安徽省口腔重點實驗室，安徽 合肥，230022）

自上世紀中期口腔種植技術出現以來，種植牙因其無需損傷鄰牙、能恢復良好的咀嚼功能、舒適美觀等優點，從眾多的缺失牙修復技術中脫穎而出，在臨床上的應用越來越多[1]。然而，在種植體植入的早期階段，種植體因細菌導致的感染會引起種植體周圍支持組織的喪失，最終導致種植失敗[2]。Fürst等研究表明，微生物菌群在種植體植入30分鐘后就已經開始在其表面定植[3]，并隨著細菌種類和數量的增加逐漸形成生物膜。由于致密的菌群生物膜能夠抵抗抗生素的作用[4]，所以僅僅在種植術前術后使用抗生素并不能完全解決種植體周圍感染問題。因此對種植體表面進行處理賦予其一定的抗菌能力，日益成為研究熱點。

對種植體表面抗菌化處理的方法多種多樣，其中在種植體表面形成抗菌涂層是一種對種植體表面改性的重要方法。目前抗菌涂層使用的抗菌材料主要包括無機抗菌材料（銀[5]、銅[6]、鋅[7]、氟及氟化物[8]等）和有機抗菌材料（抗菌肽[9]、天然多酚類[10]等）。含銀的抗菌材料雖然擁有良好的抗菌效果，但是因為其潛在的安全風險，已經被FDA由二類醫療器械升格為三類醫療器械嚴格申報和管理。抗菌肽和天然多酚等抗菌方式則因為抗菌譜較窄，難以實現對口腔復雜菌群的抗菌效果。氯己定是一種陽離子表面活性劑，具有非常強的廣譜抗菌作用，是口腔臨床主要使用的抗菌劑之一[11]。本研究通過簡單的水相沉積法，在鈦基底表面先沉積一層pDA膜，然后通過共價接枝氯己定，在鈦基底表面制備了pDA@CHX抗菌涂層。

1 材料與方法

1.1 一般材料和實驗分組

1.1.1 一般材料

純鈦購自山西寶雞有色金屬有限公司；MC3T3-E1 Subclone 14細胞購自中國科學院細胞庫；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）購自明舟生物有限公司；多巴（Dopa）、醋酸氯己定、羅丹明123（Rhodamine 123）購自上海阿拉丁公司；DMEM培養基、胰酶、胎牛血清（Fetal bovineserum，FBS）購自美國Sigma公司；

1.1.2 實驗分組

實驗共分為8組，分別為純鈦組，實驗組按氯己定濃度0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL分為7組；將純鈦組標記為Control，氯己定濃度為0組標記為pDA@CHX（0），氯己定濃度為0.05 mg/mL組標記為pDA@CHX（0.05），氯己定濃度為0.1 mg/mL標記為pDA@CHX（0.1），后同上。

1.2 涂層制備與表征

將純鈦棒（TA3）切割成直徑10 mm，厚度2 mm的鈦片，依次經80目，240目，500目，1200目，2000目砂紙拋光；然后依次在丙酮，無水乙醇，去離子水中，超聲清洗10 min，烘干備用。采用簡單的水相沉積法構建涂層。稱取一定量的多巴鹽固體粉末加入1.21 mg/mL的Tris緩沖溶液中，混勻后得到3 mg/mL的多巴Tris緩沖溶液；分別稱取一定量的醋酸氯己定固體粉末加入去離子水中，混勻后得到濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL的醋酸氯己定溶液。將鈦片浸泡于3 mg/mL的多巴Tris緩沖溶液中，室溫下靜置24 h后取出鈦片，去離子水中經超聲清洗兩次，時長分別為3 min，2 min，吹干；再將鈦片浸泡于不同濃度的氯己定溶液中，室溫靜置24 h后取出鈦片，去離子水中經超聲清洗兩次，時長分別為3 min，2 min，然后吹干備用。每組各選取1個樣品干燥后噴金30秒，利用掃描電子顯微鏡（HitachiS-480,SEM）觀察表面形貌的變化。每組各選取5個樣品，測量其表面水接觸角的大小。每組取1個樣品進行X射線光電子能譜檢測，檢測樣品表面涂層中的化學元素組成。

1.3 抗菌性能檢測

抗菌性能檢測主要通過抑菌環實驗和平板涂布法來評價涂層的抗菌性能。純鈦組和各個濃度梯度實驗組均設置三個平行樣，實驗使用的菌種為金黃色葡萄球菌。稱取一定量的腦心浸液瓊脂固體粉末（BHI瓊脂）溶解于蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫下降溫至40 ℃左右，取無菌培養皿，倒入15 ml左右BHI瓊脂，室溫下冷卻凝固備用；稱取一定量的腦心浸液肉湯（BHI肉湯）固體粉末溶于蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，室溫冷卻備用。在進行實驗前，將冷凍保存的菌種復蘇，劃線法接種至瓊脂培養皿內，放入生化培養箱內（37℃，5% CO2）培養24 h；然后使用接種環挑取單一菌落，接種至20 mL BHI肉湯培養基內，培養8 h，獲得菌液備用。

1.3.1 抑菌環實驗

在無菌超凈臺內，使用紫外燈滅菌，將樣品正反面均照射40 min后備用；取80 μL上述菌液加入瓊脂皿內，并使用涂布器將菌液均勻地涂布在瓊脂表面，將無菌樣品正面輕輕放置于瓊脂表面，使其與瓊脂完全接觸，放入恒溫生化培養箱內培養，24 h后觀察實驗結果，測量抑菌環直徑。

1.3.2 平板涂布法

將滅菌后的樣品放入無菌24孔板內，在樣品表面滴入80μL菌液，確保菌液不會從樣品表面滴落，然后將孔板放入生化培養箱內培養4h后取出，每孔加2mL BHI肉湯培養基，繼續放入培養箱內培養，24h后取出；將孔板內的液體吹勻，用BHI肉湯稀釋104倍后，取200μL滴入瓊脂皿內，涂布均勻，將培養皿放入培養箱內培養24 h后，觀察不同樣品表面的細菌數量。

1.4 細胞相容性檢測

通過熒光染色實驗，對照組和各個濃度梯度實驗組均設置三個平行樣。實驗使用細胞種類為MC3T3-E1。將滅菌的樣品放入無菌24孔板內，取適當生長周期，生長狀態良好的的MC3T3-E1細胞，去除液體培養基，PBS清洗后，使用0.25%胰酶消化，高速離心機800 r離心8 min，去除上部液體，用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸，計數板計數后，調細胞濃度為1×104/mL；每孔加入1 mL的細胞重懸液，然后分別培養1天，3天后進行熒光染色實驗。將培養了1天，3天的24孔板分別按時取出，將孔板內的樣品取出，用生理鹽水輕輕沖洗兩次，并放入新的24孔板內；每個孔內加入2 mL 2.5%的戊二醛，室溫下固定1 h；然后用生理鹽水輕輕沖洗樣品表面2次，吹干表面水分；在黑暗環境中，用羅丹明123染色劑染色30 min，用生理鹽水清洗，吹干；使用熒光顯微鏡觀察樣品表面的細胞生長形態。

2 結果

2.1 材料學表征

2.1.1 掃描電鏡

為了觀察氯己定接枝前后涂層表面形貌的差異以及不同的氯己定接枝濃度是否具有差異，本研究使用SEM對涂層的表面形貌進行觀察。如圖1所示,對鈦表面進行多巴聚合涂層的改性使鈦表面形成了一層部分球狀突起的涂層。在接枝了氯己定之后，涂層表面的球狀突起明顯增多，證明該氯己定接枝涂層的成功制備。

圖1 不同樣品的掃描電鏡結果

2.1.2 水接觸角

為探究該涂層的表面親水性能，對各分組的樣品進行了水接觸角測定。圖2結果顯示，多巴聚合涂層的構建明顯改善了純鈦表面的親水性，但是由于氯己定為強陽離子表面活性劑，具有一定的疏水性，隨著氯己定濃度的增高，涂層的疏水性增強，也從一定程度上證明了氯己定的成功接枝。

圖2 不同樣品接觸角結果

2.1.3 X 射線電子能譜

圖3為XPS檢測的各組樣品表面的全譜圖。結果顯示隨著氯己定的接枝，涂層表面出現了氯己定的特征元素氯原子，直觀的證明了氯己定的成功接枝。并且氯元素在表面占比2.74%，證明氯己定接枝量相對較高，預期能夠實現較強的表面抗菌效果。

2.2 抗菌性能檢測

2.2.1 平板涂布實驗

圖4為對照組和各實驗組樣品的細菌涂板實驗結果。純鈦組和氯己定濃度為0 mg/mL時，涂板表面長滿了細菌；相反，當氯己定濃度為0.05 mg/mL時，該涂層就已經表現出良好的抗菌性，涂板表面沒有觀察到細菌生長。

圖3 氯己定接枝前后XPS 全譜圖

圖4 不同樣品稀釋涂布平板法結果

2.2.2 抑菌環實驗

隨后，對涂層釋放的氯己定的抗菌能力進行評價，進行了抑菌環實驗。如圖5結果顯示，純鈦組和氯己定濃度為0 mg/mL時，未載氯己定的表面，未出現明顯的抑菌圈，隨著表面氯己定的接枝，樣品表面出現了明顯的抑菌圈，當氯己定濃度達到1.6 mg/mL時，在樣品周圍形成的抑菌環直徑可達14 mm左右。

圖5 不同樣品抑菌環結果

2.3 細胞相容性檢測

熒光染色實驗 圖6.為樣品表面接種細胞后分別培養1，3天后用羅丹明123染色后熒光顯微鏡下觀察結果。由圖可見，即使氯己定濃度升高至1.6 mg/mL時，細胞增殖良好，涂層仍然保持了優越的生物相容性。

圖6 不同樣品表面細胞羅丹明123 染色結果

3 討論

由于鈦及其合金優異的綜合性能（生物相容性、機械性能和低密度等），被認為是牙種植體的最佳材料[12]。然而，越來越多的研究報告了與鈦種植體相關的短期和長期并發癥，其中最為重要的并發癥就是由細菌感染引起的種植體周圍炎，種植體周圍炎最終可能會導致治療的失敗[13]。

目前，主要研究的抗菌涂層包括Ag+，Zn2+，Cu2+等金屬離子，抗菌肽以及抗細菌黏附涂層等[14]。其中，金屬離子涂層對生物細胞的作用方式主要是產生活性氧以及與細胞DNA結合進而滅活生物細胞的兩種方式[15]，對細菌沒有特異性，即在抗菌的同時會對細胞產生相同的抑制效果，因此缺乏生物安全性,一定程度上限制了其在生物材料領域的使用。抗菌肽用于表面改性是近年來抗菌表面構建的研究熱點，然而，抗菌譜較窄以及天然抗菌肽抗菌能力有限是抗菌肽表面改性不可回避的問題[16]，且抗菌肽價格偏高，臨床應用價值有限。抗黏附涂層能夠通過形成水化層抑制微生物黏附，然而水化層的抗黏附性能是無差別抗黏，同時水化層的形成對表面結構有較強的依賴性，一般適用于流體環境抗黏改性，對于種植體的改性可移植性不強[17,18]。Campbell.等通過表面誘導礦化技術形成羥基磷灰石涂層，在形成涂層的同時摻入氯己定，研究結果表明摻入氯己定組有明顯的抗菌效果，沒有摻入氯己定組未表現出抗菌效果，證明了氯己定賦予了該涂層良好的抗菌性能[19]，但是需要多次沉積。

本研究選擇貽貝靈感的多巴在基底構建富羥基的聚多巴涂層，再通過羥基和具有胍基的氯己定反應，形成轉化涂層。氯己定作為一種廣譜抗菌劑，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具極強的抗菌性，抗菌譜廣且很少有細菌對氯己定有耐藥性，因此被廣泛的應用于臨床上，用于口腔內手術術前殺菌和局部術區消毒等[20]。本研究涂層制備方法簡單高效，所制備的涂層可以完整覆蓋基底，實現無功能鈦的表面抗菌功能改性。SEM和XPS證明了pDA涂層的形成和氯己定的成功接枝。為了進一步評價該涂層的抗菌能力，本研究選取了金黃色葡萄球菌作為指示菌，進行了抑菌環實驗，相比對照組和未接枝氯己定組，接枝氯己定組鈦片周圍可以形成明顯的抑菌環，證明了其良好的抗菌性能。體外細胞實驗選取了MC3T3-E1細胞，熒光染色實驗結果表明了實驗組與對照組的細胞形態和增殖沒有明顯差異，證明了其良好的細胞相容性。

綜上所述，為解決種植體周圍炎的發生，本研究通過簡單易行的水相沉積法在鈦表面制備了pDA@CHX涂層，并對其抗菌性能和生物安全性進行了初步探究，為種植體周圍炎的預防提供了新的思路。