細胞蠟塊免疫細胞化學染色在診斷胸腔積液良惡性中的價值

楊媚

胸腔積液為臨床常見胸科疾病，有惡性良性之分，病因復雜，常見原因有結核、感染、腫瘤等，臨床為減輕患者癥狀，多以穿刺抽取積液為主，并予以常規細胞學涂片檢查，多數患者可通過此方法進行明確診斷，但對于內鏡活檢、體外穿刺及手術獲得組織的患者，實施常規細胞學涂片檢查明顯無法滿足需求[1-2]。因此，臨床迫切需要能夠明顯診斷胸腔積液，盡早為患者提供優質治療。目前，隨著精準醫療的不斷深入發展和改善，細胞蠟塊免疫細胞化學染色應時代而出現，并在胸腔積液臨床診斷中廣泛應用[3-4]。為此，筆者收集了近3年的300例患者的胸腔積液，予以細胞蠟塊免疫細胞化學染色行回顧性總結，旨在探究細胞蠟塊免疫細胞化學染色在胸腔積液診斷中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月—2019年1月期間，共收集本院病理科診斷的300例胸腹腔積液患者的胸腔積液標本，均接受常規染色顯微鏡下觀察涂片、細胞蠟塊免疫細胞化學染色。其中男女性別之比為159∶141；年齡45～80歲，平均年齡（56.68±2.35）歲。所有病理資料均經高年資病理科醫師復核，研究符合醫學倫理，入選患者均自愿參與，且簽署研究知情書。

1.2 方法

1.2.1 甲組 采用常規染色顯微鏡下觀察涂片，即：取入選患者的漿膜胸腔積液標本200～500 mL，立即送至細胞室；取漿膜胸腔積液標本20 mL放于離心管中，以3 000 r/min的速度，離心分離10 min，取沉渣棄上清液，每一個樣品標本以推拉法制片2張，待風干后，使用巴氏雙染色法予以染色處理。

1.2.2 乙組 采用細胞蠟塊免疫細胞化學染色，具體如下。（1）制備細胞蠟塊。①剩余的漿膜腔積液靜止10 min，丟棄上層液體，剩余約100 mL的標本充分混勻后，均分倒入2個50 mL離心管，以2 500 r/min的速度，離心分離5～10 min，取下層沉淀物棄上清液。若標本是血性胸腔積液，需用冰醋酸處理，離心沉淀，直至血液無。②包裹：沉淀物用吸管吸取，并安放于試鏡紙，包裹后置于脫水盒。③固定：10%福爾馬林液內裝入脫水盒2 h，避免細胞皺縮溶解和變形，影響細胞化學染色結果。④脫水：細胞塊在濃度不同的酒精（50%、70%、80%、90%、95%）各浸泡1 h后，在分別置入2個酒精濃度為100%各1.5 h，確保細胞中水分徹底清除。⑤透明：將已徹底脫水的細胞快，置入1∶1混合的二甲苯和100%酒精20 min，再置入二甲苯溶液15 min，二次置入二甲苯溶液15 min。通過二甲苯的浸泡，能夠保障石蠟與酒精徹底混合，經過逐層替換后，確保細胞內浸入石蠟容易。⑥浸蠟，首先將細胞塊浸入1∶1混合的石蠟和二甲苯的混合液30 min，隨后可將細胞塊置入純石蠟中2～3 h，共2次。另外，注意控制浸蠟期間的溫度54～56℃。⑦包埋、切片：完成浸蠟的細胞塊，將其密封在小蠟塊中完成包埋工作，包埋完成后的細胞塊可長期保存，多次重復進行切片。（2）免疫細胞化學染色。①切片：制作細胞蠟塊切片，其厚度在2～3 μm，隨后置入烤箱（65℃）60 min后，移出，冷卻至室溫。②脫蠟和水化：選新鮮二甲苯，將石蠟切片置入，共浸泡2次，20 min/次。除去多余液體，選無水酒精，共浸泡2次，3 min/次。出去多余液體，選95%酒精，共浸泡3 min；除去多余液體，選85%酒精，共浸泡3 min；最后，自來水連續沖洗1 min。③阻斷內源性過氧化物酶：選3% H2O2溶液，置入染色架，連續浸泡5～10 min后，使用PBS溶液沖洗，3 min/次，共3次。④抗原修復：取修復液適量，置入壓力鍋，大功率加熱至沸騰，功率調至中度，并置入染色架，壓力閥扣上，不終止加熱。待壓力閥噴氣，計時2 min。壓力鍋停止加熱，并移走，壓力鍋流水沖淋，直至修復液冷卻，蒸餾水連續沖洗切片3次，并對待測組織區域使用圓珠筆圈定在玻片上，使用PBS溶液沖洗3 min，共3次。⑤加一抗：除去PBS溶液后，加一抗100 μL，孵育60min（室溫下），PBS沖洗3 min，共計3次。已知陽性切片、PBS代替一抗為惡性對照、良性對照。⑥加酶標二抗：PBS溶液除去，加酶標二抗100 μL，孵育15 min（室溫下），使用PBS溶液沖洗3 min，共3次。⑦DAB顯色：PBS溶液除去，取新鮮配置的DAB顯色液100～200 μL，孵育3～5 min（室溫下），沖洗使用清水。⑧復染：清水沖洗后，置入蘇木素染缸10～30 s后，自來水沖洗至返藍。⑨脫水：依次在85%、95%、100%酒精中各浸泡3 min。⑩透明：二甲苯。 封片：中性樹膠、蓋玻片；閱片：光學顯微鏡下閱片。

表1 300例患者積液檢查結果對比

表2 乙組檢測的良性組和惡性組中不同標記物免疫細胞化學染色結果對比[例（%）]

1.3 觀察指標

檢測結果分析工作有2名或以上資深診斷醫師完成，使用En-Vision法，研究所用試劑均購自北京中杉，如：甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、細胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）及間皮細胞（mesothelial cell，MC）等；陽性為棕褐色、棕黃色，表示胸腔積液為惡性；陰性為無色、染色淺及陽性細胞占同類細胞的5%，表示胸前積液為良性。

以Light標準為積液性質診斷的“金標準”[5]，即：滿足以下三條之一，即可證明積液是陽性（惡性），（1）胸液蛋白/血清蛋白＞0.5；（2）胸液乳酸脫氫酶/血清乳酸脫氫酶＞0.6；（3）胸液乳酸脫氫酶＞2/3血清乳酸脫氫酶正常值。上述3條均不符合，則表示為陰性（積液為良性）。

1.4 統計學處理

數據處理采用統計學軟件SPSS 25.0，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者積液檢查結果

參考Light標準判斷，300例受檢患者中，檢出良性患者32例惡性檢出人數為268例，不確定0例。其中甲組行常規染色顯微鏡下觀察涂片的檢查結果顯示，良性（未查見癌細胞）52例，惡性（查見癌細胞）223例，不確定患者有25例（經病理學、影像學等證明，良性9例，惡性16例）。乙組行細胞蠟塊免疫細胞化學染色的檢查結果顯示，良性42例，惡性258例，不確定0例。

2.2 患者積液檢查惡性率、漏檢率結果對比

甲組的惡性檢出率為74.33%（223/300），漏檢率為15.00%（45/300）。乙組惡性檢出率為86.00%（258/300），漏檢率為3.33%（10/300）。乙組惡性檢出率高于甲組、漏檢率低于甲組（P＜0.05），見表1。

2.3 乙組檢測的良性組和惡性組中不同標記物免疫細胞化學染色結果對比

惡性組的TTF-1、CEA、CK7表達率高于良性組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），但兩組的CK20、MC表達率比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

胸腔積液為臨床常見疾病，準確地判斷良惡性對患者疾病診治、預后意義重大。若疾病未及時檢出，極易延誤患者最佳治療時機，影響患者后續治療，甚至危及患者生命安全。因此，做好胸腔積液檢查工作意義重大。既往胸腔積液離心后，多制作細胞涂片后，對涂片進行觀察，是臨床最基本診斷方式。雖然能夠幫助臨床解決一定的實際問題，但無法滿足現有臨床需求[6]。因胸腔積液中存在呈現分離狀的細胞和組織，利用常規涂片觀察法無法對其良、惡性進行觀察，且在多種因素影響下，如：細胞量少、細胞變性或重疊以及涂片質量差等，極易錯誤判斷患者疾病[7]。

目前，外科組織病理學常用免疫組織化學進行臨床診斷，有助于判斷待測腫瘤相關信息，如：良惡性、組織來源及亞型[8]。如何在細胞學中應用免疫組織化學，臨床想了多種方式，如：多張涂片免疫細胞化學染色、細胞涂片退染免疫細胞化學染色及細胞蠟塊免疫細胞化學染色技術。

細胞蠟塊制備，是通過離心細胞懸浮液得到細胞塊，再經固定、脫水、包埋等操作后得到細胞蠟塊[9]。目前，臨床常用細胞塊制作方式，大體分為兩種，分別是有試管包埋法、離心管沉淀制備法的直接法和Histo Gel制備法、雄姿細胞塊制備的間接法。本次研究選擇應用離心沉淀制備法，細胞蠟塊富含豐富的有核細胞層，具有細胞數量多、染色鮮艷、組織結構保存完整等優勢。同時，細胞蠟塊，可連續切片和長期保存，使細胞學具備組織病理學特點，故細胞蠟塊免疫細胞化學染色已成為胸腔積液性質判斷的重要手段，制備好的細胞蠟塊可行多次切片處理，因此臨床醫師可多次重復檢查可以細胞，若檢測出棕褐色的顆粒，表示此胸腔積液性質為惡性，故使用細胞蠟塊免疫細胞化學染色的檢出率高[10]。另外，細胞蠟塊免疫細胞化學染色的流程不繁瑣，便于進行下一步的分析蠟塊免疫組化，有利于臨床醫師準確判斷和分析組織的來源。與常規染色顯微鏡下觀察涂片相比，應用優勢極為明顯，主要是應用細胞蠟塊免疫細胞化學染色法后，幾乎不出現細胞丟失問題，其結果也不受細胞量的多少影響，從而明顯提升胸腔積液的惡性檢出率[11]。

胸腔積液需要一組標志物對其炎癥反應、間皮瘤還是轉移瘤進行鑒別診斷，常用的是TTF-1、CEA、CK7、CK20及MC等。TTF-1是一種核蛋白，分子量為38 kDa，于呼吸道上皮細胞等部位選擇性表達，故是一種較為理想的檢測肺癌性胸腔積液的標志物。CK7分子量為54 kDa，常于卵巢、肺等組織的上皮細胞表達，幾乎不于胃腸道表達。有學者指出[12]，細胞蠟塊免疫細胞化學染色檢測TTF-1、CK7、CK20，能夠找出胸腔積液的來源。在本次研究中，乙組惡性檢出率高于甲組，漏檢率低于甲組（P＜0.05）。惡性組的TTF-1、CEA、CK7表達率高于良性組（P＜0.05），但CK20、MC表達在兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。可見于常規染色顯微鏡下觀察涂片相比，應用細胞蠟塊免疫細胞化學染色法對胸腔積液的惡性檢出率高。同時，細胞蠟塊免疫細胞化學染色法還可提供客觀的細胞病理學診斷依據，初步判斷腫瘤細胞的形態，不僅可以判斷胸腔積液的良惡性，還可明確腫瘤細胞的病理類型，揭示組織來源確定診斷范圍。

綜上所述，在胸腔積液診斷中，應用細胞蠟塊免疫細胞化學染色法胸腔積液惡性檢出率明顯高于常規染色顯微鏡下涂片，且可進一步明確轉移癌的來源及類型。細胞蠟塊具有長時間保存優勢，因此細胞蠟塊免疫細胞化學染色法對提高細胞學診斷準確性有較大幫助。當前，已有在宮頸及非婦科液基細胞學的細胞蠟塊免疫細胞化學染色法已有研究。在今后的工作中，學者將不斷總結經驗，不斷提高細胞學診斷水平。