銨離子對(duì)多殺菌素發(fā)酵生產(chǎn)的影響

張 松， 扶教龍， 徐敏強(qiáng)， 汪佳琪， 張 瀚， 胡翠英， 白 凈

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

多殺菌素（spinosad）是一種由刺糖多孢菌生產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，Spinosyn A（約85%）和Spinosyn D（約15%）是主要的活性成分[1-2]。在功能上，多殺菌素是一種廣譜生物殺蟲劑，能有效抑制膜翅目、鞘翅目、雙翅目病蟲害[3]；在結(jié)構(gòu)上，多殺菌素是由一個(gè)21-碳四環(huán)骨架與兩個(gè)6-碳脫氧糖（D-福樂糖胺和L-鼠李糖）相連而成[4]。 多殺菌素與一些傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑相比，具備高效性、生物安全性和環(huán)境友好性等優(yōu)點(diǎn)[5]。 我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，對(duì)殺蟲劑有著極大的市場(chǎng)需求[6]。 目前，多殺菌素及其衍生物先后三次獲得“美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”[7]。但是，我國(guó)多殺菌素研究水平較低[8]。因此，通過菌種選育和條件優(yōu)化等方法來(lái)提高多殺菌素的產(chǎn)量具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

刺糖多孢菌的生長(zhǎng)需要必要的碳氮源，對(duì)培養(yǎng)基的成分和濃度進(jìn)行優(yōu)化能有效提高多殺菌素產(chǎn)量[9]。趙晨等[10]通過部分因子設(shè)計(jì)、陡坡實(shí)驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)，將多殺菌素產(chǎn)量由115.1 mg·L-1提至180.6 mg·L-1。張峰等[11]在Plackett-Burman、Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化培養(yǎng)基，最終將多殺菌素產(chǎn)量提高了145%。銨離子（NH4+）在微生物培養(yǎng)中通常被作為氮素代謝原料，其在細(xì)胞內(nèi)核酸、氨基酸和輔因子等含氮化合物的合成中扮演重要角色[12]。 多項(xiàng)研究表明，NH4+能顯著影響大環(huán)內(nèi)脂抗生素的生物合成。 在梅嶺霉素的發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)5 mmol·L-1的硫酸銨能夠有效地提升菌體量和產(chǎn)物合成，并且不同濃度的硫酸銨會(huì)對(duì)相關(guān)酶的活性產(chǎn)生影響，以此改變菌體內(nèi)部代謝通量[13]。 鄭夢(mèng)潔在NH4+對(duì)阿維菌素生產(chǎn)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，銨離子通過影響孢外淀粉酶等一系列酶的活性，影響終產(chǎn)物的合成[14]。 此外，陶文娜通過對(duì)刺糖多孢菌銨載體蛋白基因amtS 的異源表達(dá)，證明銨載體蛋白能夠提高鏈霉菌中次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[15]。 已有文獻(xiàn)中，多殺菌素發(fā)酵生產(chǎn)常用的氮源一般只有棉籽蛋白或酵母膏等單一有機(jī)氮源，而不含硫酸銨等無(wú)機(jī)氮源[16-18]。 因此，本文首次嘗試在培養(yǎng)基中添加硫酸銨，研究銨離子對(duì)多殺菌素發(fā)酵生產(chǎn)的影響，以期提高多殺菌素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌種Saccharopolyspora spinosa 3-37 為本實(shí)驗(yàn)室由原始菌株S.spinosa ATCC49460 經(jīng)抗性篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基

平板活化和斜面固體培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉浸膏1、酵母提取物1、葡萄糖10、酸水解酪蛋白2、瓊脂20，pH 值為7.2，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖15、黃豆餅粉3、淀粉10、大豆蛋白胨25、棉籽蛋白3、MgSO4·7H2O 2，pH 值為7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基（g·L-1）：葡 萄 糖50、棉 籽 蛋 白20、K2HPO4·3H2O 1、NaCl 3、FeSO4·7H2O 0.05、CaCO31，pH 值為7.2，121 ℃滅菌20 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g·L-1）：棉籽蛋白200、葡萄糖400，pH 值調(diào)至6.8。

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化：將甘油保存菌劃線接種平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d 至孢子成熟。 成熟單菌落使用接種環(huán)劃線接種，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d。

種子培養(yǎng)：用生理鹽水沖洗斜面孢子，取1 mL 菌懸液轉(zhuǎn)接種子液（50 mL），28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：搖瓶發(fā)酵，在250 mL 的搖瓶中裝液40 mL，10%接種量（V∶V）接種，28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)7～10 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 硫酸銨濃度對(duì)多殺菌素生產(chǎn)的影響

配制0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 g·L-1的硫酸銨培養(yǎng)基，測(cè)定不同硫酸銨濃度下多殺菌素產(chǎn)量變化。

1.4.2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種多因素2 水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以相對(duì)少的實(shí)驗(yàn)組數(shù)從中篩選重要因子[19]。 該實(shí)驗(yàn)選取葡萄糖、棉籽蛋白、硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、碳酸鈣作為考察因子，使用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)7 因素2 水平的12 組組合試驗(yàn)，并進(jìn)行回歸分析，得出重要影響因子。

1.4.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)得出影響程度最高的3 個(gè)因素，根據(jù)方程系數(shù)的正負(fù)大小判斷爬坡的方向和步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)爬坡實(shí)驗(yàn)組。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化方法

根據(jù)上述陡坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面分析表及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)的培養(yǎng)基濃度配比。

1.4.5 5 L 罐分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵

將優(yōu)化培養(yǎng)基配制3 L 置于5 L 發(fā)酵罐中，10%接種量（V∶V），30 ℃下進(jìn)行分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，0～60 h 維持pH 值為7.2，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；60～180 h 維持pH 值為6.8[20]。

1.5 參數(shù)測(cè)定

1.5.1 菌體濃度和葡萄糖濃度

用移液槍吸取10 mL 發(fā)酵液至10 mL 離心管中，4 000 r·min-1離心15 min，上清液稀釋一定倍數(shù)，于生物傳感分析儀（SBA-40C）測(cè)定葡萄糖濃度；沉淀用蒸餾水洗滌2 次，最后將沉淀物置于60 ℃烘箱中烘干稱重，計(jì)算菌體濃度（DCW）。

1.5.2 多殺菌素含量

取發(fā)酵液2 mL，加入等體積甲醇，用漩渦混合器或顛倒充分搖勻，超聲破碎細(xì)胞15 min，置于暗處過夜保存，4 000 r·min-1離心15 min，上清液過濾處理后，利用高效液相色譜儀（HPLC）進(jìn)行分析[21]，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多殺菌素產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨濃度對(duì)多殺菌素生產(chǎn)的影響

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)硫酸銨濃度大于1.5 g·L-1時(shí)，多殺菌素的生產(chǎn)受到抑制。 因此，適當(dāng)降低硫酸銨濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示。 由圖1 可見，硫酸銨濃度在0～0.75 g·L-1范圍內(nèi)，多殺菌素產(chǎn)量會(huì)隨著硫酸銨濃度的增加而增加，當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到0.75 g·L-1時(shí)，多殺菌素產(chǎn)量達(dá)到最大值71.0 mg·L-1，較未添加硫酸銨培養(yǎng)基產(chǎn)量（65.0 mg·L-1）提高了9.2%。

上述結(jié)果說明低濃度（0.75 g·L-1）的硫酸銨對(duì)多殺菌素的產(chǎn)量提高有一定的促進(jìn)作用。 在此基礎(chǔ)上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)包含硫酸銨成分的發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選影響多殺菌素產(chǎn)量的顯著因素

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基的7 種成分作為考察因子。 使用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用高（+1）和低（-1）兩水平，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選顯著因子，見表1、表2、表3（表格中：A 為葡萄糖，B 為棉籽蛋白，C 為硫酸銨，D 為氯化鈉，E 為磷酸氫二鉀，F(xiàn) 為硫酸亞鐵，G 為碳酸鈣）。

圖1 硫酸銨對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的影響

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)不同因子及水平 單位：g·L-1

表2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

由表2 數(shù)據(jù)可得線性回歸方程：Y=60.33+3.17A+1.47B+0.68C-0.20D+0.22E-0.50F-0.072G。 表3 數(shù)據(jù)表明，在7 個(gè)因素中，葡萄糖、棉籽蛋白和硫酸銨對(duì)多殺菌素的產(chǎn)量影響高于其他幾種，且都為正效應(yīng)，可以在后續(xù)試驗(yàn)中適當(dāng)增加濃度，而其余因素根據(jù)系數(shù)正負(fù)，選擇相應(yīng)的最適水平[22]。

2.3 最陡坡實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)只能判斷因素重要性，但缺乏對(duì)因素最優(yōu)水平的確定，而響應(yīng)面只能預(yù)測(cè)相鄰區(qū)域產(chǎn)量[23]。 因此，必須根據(jù)方程系數(shù)的正負(fù)大小設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組，尋求最大產(chǎn)量區(qū)域，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4。

表 4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

由于3 種因素的系數(shù)都為正值，應(yīng)當(dāng)逐漸增加濃度。表4 的結(jié)果說明，隨著3 種因素的濃度逐漸增加時(shí)，多殺菌素的產(chǎn)量會(huì)呈現(xiàn)先增大后縮小的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖50 g·L-1、棉籽蛋白25 g·L-1、硫酸銨1.0 g·L-1時(shí)，產(chǎn)量最高。 因此，將此條件作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法分析

2.4.1 模型建立

以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，挑選了銨離子、葡萄糖和棉籽蛋白3 個(gè)因素，采用3 因素3 水平設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，將各因素中多殺菌素產(chǎn)量最高的條件標(biāo)記為“0”，低于和高于此條件的數(shù)值分別標(biāo)記為“-1”和“1”，見表5。

使用Design-Expert 軟件將上述因素水平生成15 個(gè)組合試驗(yàn)[24]，從而考慮不同因素的相互作用和對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的影響，見表6。

表5 多殺菌素響應(yīng)面的因素水平設(shè)計(jì)

表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 回歸模型的擬合方差分析

使用Design-Expert 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到回歸模型方差分析表（見表7）。

表7 回歸模型方差分析

通過軟件分析得到多殺菌素產(chǎn)量的回歸方程為

由表7 中的數(shù)據(jù)可知，此模型P＜0.000 1，說明此模型達(dá)到顯著水平；模型的失擬項(xiàng)P=0.340 1＞0.05，說明了此模型的失擬項(xiàng)并不顯著，具有應(yīng)用意義。此外，模型可信度相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，說明模型的相關(guān)度比較好，能夠很好地預(yù)測(cè)3 因素與多殺菌素產(chǎn)量之間的關(guān)系；校正系數(shù)R2Adj=0.994 1，表明了該模型與實(shí)驗(yàn)擬合度較高，可以用來(lái)做理論值推算，可信度較高。

2.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

圖2 葡萄糖和棉籽蛋白對(duì)多殺菌素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖

圖3 葡萄糖和硫酸銨對(duì)多殺菌素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖

根據(jù)回歸方程對(duì)硫酸銨、葡萄糖、棉籽蛋白3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)圖繪制（如圖2、圖3、圖4 所示），每個(gè)圖代表其中兩個(gè)因素對(duì)多殺菌素產(chǎn)量影響的交互作用。 由圖2、圖3、圖4 可知，多殺菌素的產(chǎn)量會(huì)受到每個(gè)因素的影響，當(dāng)其中某個(gè)因素含量不變，另一成分含量增加，多殺菌素產(chǎn)量也會(huì)隨之增加，當(dāng)該成分超過某值時(shí)，多殺菌素會(huì)隨著其成分的增加而降低。以圖3 為例，當(dāng)硫酸銨濃度一定時(shí)，多殺菌素產(chǎn)量會(huì)隨著葡萄糖濃度增加而增加， 但當(dāng)葡萄糖濃度超過51.3 g·L-1時(shí)，多殺菌素產(chǎn)量會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 反之，保證葡萄糖濃度一定，硫酸銨也有相同趨勢(shì)。 同理，發(fā)現(xiàn)圖2 和圖4 也有相同規(guī)律。

圖4 棉籽蛋白和硫酸銨對(duì)多殺菌素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖

2.4.4 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過軟件分析，預(yù)測(cè)3 因素最佳濃度配比以及最高多殺菌素產(chǎn)量，結(jié)果如下：葡萄糖51.3 g·L-1，棉籽蛋白25.7 g·L-1，硫酸銨1.16 g·L-1，此條件下多殺菌素的預(yù)測(cè)產(chǎn)量為80.2 mg·L-1。為了驗(yàn)證正確性，在此條件下做3 組平行實(shí)驗(yàn)，平均值80.7 mg·L-1，與多殺菌素理論值接近，模型可信，具有實(shí)用價(jià)值。

2.5 5 L 罐分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵

刺糖多孢菌在5 L 發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵過程參數(shù)變化如圖5 所示。 從圖5 可以看出，60 h 前，葡萄糖消耗速率較快，菌體生長(zhǎng)旺盛，而多殺菌素產(chǎn)量較低，碳氮源的消耗主要用于菌株生長(zhǎng)。 80 h 后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期，并在108 h 時(shí)，菌體量達(dá)到峰值26.9 g·L-1，葡萄糖由于菌體生長(zhǎng)的大量消耗，其消耗速率開始降低，濃度降至低水平。 同時(shí)，在積累充足菌體量后，多殺菌素的生產(chǎn)速率急劇上升，在144 h 時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大90.5 mg·L-1，較搖瓶發(fā)酵提高了12.1%。 但是，由于前期大量碳氮源用于菌株生長(zhǎng)，108 h 后碳氮源濃度就處于較低水平，菌體量也由于營(yíng)養(yǎng)限制呈下降趨勢(shì)，限制了產(chǎn)物的積累。

為了解決分批發(fā)酵中后期碳氮源不足的問題，在發(fā)酵96 h 時(shí)，采用連續(xù)補(bǔ)料流加葡萄糖和棉籽蛋白混合液，維持葡萄糖濃度在10 g·L-1左右，結(jié)果如圖6 所示。 圖6 表明，連續(xù)補(bǔ)料解除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的限制，在216 h 和240 h 時(shí)，菌體量和多殺菌素產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為42.1 g·L-1和158.3 mg·L-1，較分批發(fā)酵提高了56%和74.8%，產(chǎn)量較搖瓶發(fā)酵提升了96.2%。 上述結(jié)果表明，銨離子確實(shí)可以促進(jìn)多殺菌素的合成。

圖5 5 L 罐中多殺菌素分批發(fā)酵生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)曲線

圖6 5 L 罐中多殺菌素補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)曲線

3 結(jié)語(yǔ)

通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.75 g·L-1的硫酸銨， 多殺菌素?fù)u瓶發(fā)酵產(chǎn)量提高9.2%， 后經(jīng)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化后，優(yōu)化培養(yǎng)基配方為（g·L-1）：葡萄糖51.3、棉籽蛋白25.7、硫酸銨1.16、NaCl 3、K2HPO4·3H2O 1.5、FeSO4·7H2O 0.05、CaCO31，在此優(yōu)化條件下多殺菌素產(chǎn)量為80.7 mg·L-1，較未添加硫酸銨培養(yǎng)基提升13.7%。 接著，在5 L 罐中利用該優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)，最終多殺菌素產(chǎn)量為90.5 mg·L-1和158.3 mg·L-1，分別較搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量提升了12.1%和96.2%。 相關(guān)研究果表明，銨離子能通過影響鏈霉菌菌株內(nèi)某些氨基酸脫氫酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，以此改變相關(guān)氨基酸的代謝和前體合成水平，最終影響抗生素的生物合成[25]。在本研究中，適當(dāng)添加低濃度硫酸銨有效地促進(jìn)了多殺菌素生產(chǎn)，其原因可能是低濃度的硫酸銨促進(jìn)了前體乙酰CoA 和丙酰CoA 的合成。 此外，低濃度的銨離子縮短刺糖多孢菌生長(zhǎng)周期、提高菌體生長(zhǎng)水平的能力[26]，也可能是促進(jìn)多殺菌素產(chǎn)量增加的原因。 本文為刺糖多孢菌培養(yǎng)基研究提供了新思路，可為提高多殺菌素的產(chǎn)量提供有益的參考。