芹菜素對深Ⅱ度燒傷模型大鼠急性肺損傷保護作用及機制研究

戴如冰 陳 驊

燒傷是較為常見的外傷性疾病，不僅損害皮膚等熱力直接接觸的組織或器官，還可誘發全身多組織器官并發癥，其中急性肺損傷是燒傷早期即出現的并發癥，也是導致燒傷患者死亡的主要原因之一[1-2]。研究發現，氧化應激和炎癥反應在燒傷致急性肺損傷的進展過程中發揮重要作用[3]。芹菜素是一種存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，以芹菜中含量最高，具有良好的抗氧化、抗炎等生理活性[4-5]。根據燒傷深度“三度四分法”分級，臨床上以深Ⅱ度燒傷最為常見[6]。本實驗以深Ⅱ度燒傷模型大鼠為研究對象，以臨床一線治療用藥地塞米松為陽性對照藥物，研究芹菜素對燒傷大鼠急性肺損傷的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性Wistar 大鼠180只，體質量220～250g，購自浙江省醫學科學院，許可證號：SCXK（浙）2017-0010，動物合格證號：202 004013；實驗前適應性飼養7 天，飼養條件設置：光照黑暗各12h 交替、室溫23～25℃、相對濕度55%～65%。本實驗通過中國人民武裝警察部隊海警總隊醫院倫理委員會批準，倫理批件號：HJLL[K]字2019-026，實驗過程嚴格按照倫理審批通過的方案執行。

1.2 主要藥物與試劑 芹菜素購自陜西慧科植物開發有限公司（批號190524，純度≥98%）；地塞米松注射液（規格：1mL:5mg；批號1903016）購自山東大陸藥業有限公司；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴藥業有限公司（批號20190426）；髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號20191208、2020 0113、20191125、20191218）；腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）。

1.3 主要儀器 YLS-5Q 型燙傷儀（天津科技發展有限公司）；NF05DH-1831 型血氣分析儀（廣州華西科創科技有限公司）；YB-7LF 型組織包埋機（湖北亞光公司）；CUT 4050 型旋轉切片機（德國Leica 公司）；CKX41 型倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；UV2100 型紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；Model 680 型酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 動物分組、模型制備與給藥（1）動物分組：將180 只實驗用大鼠按隨機數字表法分為假燒傷組、模型組、地塞米松5mg/kg 組[7]和芹菜素12.5、25、50mg/kg組，各30 只。（2）模型制備[8]：大鼠造模前禁食禁水12h，3mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剃除背毛并使用濃度8%的硫化鈉脫毛，脫毛部位75%乙醇消毒。假燒傷組大鼠腹腔注射5mL 乳酸鈉林格溶液；其余各組大鼠通過燙傷儀（溫度106℃、壓力0.03MPa、持續時間5s）制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，病理切片呈現部分真皮層內細胞壞死、部分毛囊等附件殘存、毛細血管內可見血液淤滯等認為造模成功[9]，見圖1-2；造模后立即腹腔注射5mL 乳酸鈉林格溶液。（3）給藥：地塞米松5mg/kg 組腹腔注射5mg/mL 地塞米松溶液，芹菜素12.5、25、50mg/kg 組分別腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 芹菜素溶液（芹菜素加0.9%氯化鈉溶液制備），假燒傷組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；各組注射劑量均為1mL/kg、給藥頻次均為1 天1 次，連續給藥14 天。

圖1 各組大鼠創面大體情況

圖2 各組大鼠創面皮膚病理切片（HE 染色×400）

1.5 肺功能指標檢測 各組分別隨機取10 只大鼠，計數呼吸頻率；麻醉后，經腹主動脈通過抗凝采血管取血，通過血氣分析儀檢測血氧分壓（PaO2）值。經腹主動脈取血并4℃離心（轉速3000rpm，時間10min）后取血漿；經脊椎脫臼處死后，開胸取肺組織、結扎右側主支氣管，取5mL 4℃預冷PBS 溶液灌洗左肺并收集灌洗液，4℃離心（轉速3000rpm，時間10min）后取上清液；然后采用溴甲酚氯法分別檢測血漿和肺泡灌洗液中的蛋白含量，肺泡通透指數=支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量/血漿蛋白含量。

1.6 肺指數計算 各組分別隨機取10 只大鼠，稱量體質量；麻醉狀態下脊椎脫臼處死、開胸取肺組織，生理鹽水沖洗并濾紙拭干后稱量肺質量，肺指數=肺質量/體質量。

1.7 肺組織病理學檢查及損傷評分 取“1.6”稱重后的肺組織，置4%多聚甲醛溶液中固定72h，石蠟包埋，5μm 厚度連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗后行常規HE 染色（蘇木精溶液染色5min、濃度1%的鹽酸酒精分化3s，0.6%氨水返藍、伊紅溶液染色1min），然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹脂封片，通過倒置光學顯微鏡觀察肺組織病理學變化并照相。參照卜克等[10]報道的方法進行損傷評分：通過顯微鏡觀察病理切片，在肺泡水腫、肺泡出血、炎癥細胞浸潤、肺不張、透明膜形成五個方面進行評價，正常、輕度、中度、重度分別計分0、1、2、3 分，總計15 分。

1.8 肺細胞凋亡觀察及凋亡指數（AI）計算 取“1.7”制備的肺組織石蠟切片，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后，按照TUNEL 試劑盒操作步驟進行染色處理，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后50%甘油封片，通過倒置光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況（細胞核黃色或黃褐色為陽性著色）。AI 計算：每只大鼠取相同部位切片，每張切片取互不重疊的5 個視野，分別計數視野中細胞總數和凋亡細胞數，AI（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.9 肺細胞超微結構觀察 取1mm×1mm×1mm 肺組織標本，依次置于2.5%戊二醛固定6h、1%鋨酸固定1h，梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋、70nm 超薄切片、醋酸鈾浸泡、枸櫞酸鉛染色、沖洗、干燥處理后，通過透射電子顯微鏡觀察肺細胞超微結構。

1.10 肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量檢測 取各組剩余的10 只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死，開胸取肺組織、4℃預冷生理鹽水沖洗，加入適量4℃冷裂解液、研磨勻漿后，4℃、3500rpm 離心10min取上清液，采用比色法檢測MPO 活性、黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活性、高錳酸鉀滴定法測定CAT 活性以及硫代巴比妥酸法測定MDA 含量。

1.11 肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量檢測 取“1.10”制備的肺組織勻漿液，4℃、3500rpm 離心10min 取上清液，按照ELISA 試劑盒操作步驟進行處理后，通過酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.12 統計學方法 應用SPSS 15.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠呼吸頻率和肺泡通透指數升高，PaO2降低（P 均＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組呼吸頻率和肺泡通透指數降低，PaO2升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組大鼠肺泡通透指數降低更明顯，PaO2升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響（）

表1 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；PaO2為氧分壓；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.2 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺指數升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg組肺指數降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組肺指數降低更明顯（P＜0.05）。見表2。

表2 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數、損傷評分和AI 的影響（）

表2 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數、損傷評分和AI 的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；AI 為凋亡指數；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.3 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織病理學改變的影響 假燒傷組大鼠肺組織結構清晰、肺間質較薄、肺泡連接緊密、未見出血和炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織呈現結構模糊、肺間質水腫增厚、大量炎性細胞浸潤、肺泡內可見紅細胞滲出等病理性改變；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素各劑量組肺組織形態結構改變不同程度好轉；其中芹菜素50mg/kg 組肺結構較為清晰、肺間質增厚和炎性細胞浸潤不明顯，效果優于其他組（見圖3）。損傷評分：與假燒傷組比較，模型組大鼠損傷評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組損傷評分降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組損傷評分降低更明顯（P＜0.01）。見表2。

2.4 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺細胞凋亡的影響假燒傷組大鼠肺組織僅可見極少量的凋亡細胞；與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織凋亡細胞數量明顯增多，AI 升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組大鼠肺組織凋亡細胞數量減少、AI 降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組AI 降低更明顯（P＜0.01）。見圖4 和表2。

2.5 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺細胞超微結構改變的影響 假燒傷組大鼠肺泡上皮細胞胞膜和核膜邊界清晰、結構完整，胞核周圍存在少量板層小體；模型組呈現肺泡上皮細胞腫脹、胞膜破裂、邊界不清，核膜、核仁邊界不清，胞核周圍板層小體數量明顯增多等超微結構改變；與模型組比較，地塞米松5mg/kg組和芹菜素各劑量組細胞超微結構改變呈不同程度好轉，其中芹菜素50mg/kg 組改善效果優于其他組。見圖5。

圖3 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織病理的影響（HE 染色×200）

圖4 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺細胞凋亡的影響（TUNEL ×200 倍）

2.6 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性降低且MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg組SOD 活性升高、MDA 含量降低（P＜0.05），芹菜素25、50mg/kg 組MPO、SOD、CAT 活性升高且MDA 含量降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組MPO、SOD 活性升高且MDA 含量降低更明顯（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

2.7 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組TNF-α 含量降低更明顯（P＜0.01）。見表4。

圖5 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺細胞超微結構改變的影響（透射電子顯微鏡×10000）

表3 菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（）

表3 菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；MPO 為髓過氧化物酶；SOD 為超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化物酶；MDA 為丙二醛；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

表4 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響（pg/mL，）

表4 芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響（pg/mL，）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細胞介素-1β；IL-6 為白細胞介素-6；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.01

3 討論

急性肺損傷是燒傷最常見并發癥之一，也是導致中重度燒傷患者死亡的重要原因。研究表明，除吸入性損傷外，燒傷所致血管活性物質（前列腺素、組胺等）、炎癥細胞因子、氧自由基（ROS）等大量生成與釋放，進而引發肺血管通透性增加與肺組織水腫以及炎癥反應與氧化應激損傷，是燒傷后并發急性肺損傷的重要機制[1-3]。

深Ⅱ度燒傷傷及真皮網層，但燒傷創面仍有部分毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附件殘存，若處理不當則可能導致創面加深而轉變成Ⅲ度燒傷，從而增加治療難度并影響預后[11]。所以，深Ⅱ度燒傷治療結局具有較大的可變性，也是燒傷相關研究的熱點。芹菜素是自然界中廣泛存在的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物活性；既往研究發現，芹菜素能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應對內毒素和百草枯所致急性肺損傷起到保護作用[12-13]。本研究采用溫度106℃、壓力0.03MPa 持續5s 的方法制備深Ⅱ度燒傷模型大鼠，經芹菜素治療14 天能夠明顯改善深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能（降低呼吸頻率和肺泡通透指數，提高PaO2）、降低肺指數、抑制細胞凋亡、改善肺組織形態結構病變和細胞超微結構病變，并且芹菜素50mg/kg 組上述作用優于或相當于地塞米松組，提示芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠急性肺損傷具有保護作用。

生理狀態下，ROS 能夠被SOD、CAT 逐步催化還原而維持動態平衡；但燒傷導致ROS 異常大量釋放而過度消耗SOD 和CAT，導致ROS 代謝失衡而過剩是導致氧化應激反應的物質基礎[14]；此外，主要存在于中性粒細胞的MPO 能夠清除ROS 而抑制氧化應激損傷[15]。體內蓄積的ROS 將攻擊蛋白質、染色體以及生物膜等生成具有生物毒性的MDA。本研究發現，經芹菜素治療14 天能夠顯著提高深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性并降低MDA 含量，芹菜素50mg/kg 對MPO、SOD 和MDA 的調節作用優于地塞米松組，提示芹菜素對深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織氧化應激損傷具有抑制作用。

燒傷導致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 大量合成與釋放而引發機體組織炎癥反應，并且TNFα、IL-1β 做為趨化因子能夠進一步促進自身及IL-6表達上調，從而形成炎癥級聯反應而加重炎癥損傷[16-17]；此外IL-6 能夠刺激ROS 合成與釋放，從而加重氧化應激損傷[18]。本研究發現，經芹菜素治療14 天能夠顯著降低深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，芹菜素50mg/kg 對TNF-α 的調節作用優于地塞米松組，提示芹菜素對深Ⅱ度燒傷模型大鼠肺組織炎癥反應具有抑制作用。

綜上所述，芹菜素對深Ⅱ度燒傷模型大鼠急性肺損傷具有保護作用，可能與抑制氧化應激和炎癥反應有關。而芹菜素對燒傷所致其他臟器損傷是否也具有保護作用，還有待于進一步研究。