白楊素通過下調p38-MAPK 磷酸化減輕膿毒癥大鼠心肌損傷

郭正亮 俞許超 周 宇 趙敬平 金雪梅 趙 輝

心臟是膿毒癥的靶損害器官，其特征是心室擴張，收縮力降低和對液體療法的心室反應減弱[1]。有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）家族成員p38-MAPK 在心肌抑制中起著至關重要的作用[2]。激活的p38-MAPK 上調細胞因子如白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，以及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，其通過促進心肌肥大，刺激收縮功能障礙和誘導心肌細胞導致心力衰竭細胞凋亡[3-4]。白楊素又稱白楊黃素，是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種具有廣泛藥理活性的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，白楊素對膿毒癥有腎臟保護作用，并降低炎癥標志物IL-2、IL-4 和IL-6 的水平[5]。本研究擬探討白楊素減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的機制，為膿毒癥治療提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級SD 大鼠100 只，8 周齡，體質量（210±10）g，由東南大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0013，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0043，動物質量合格證號：2019031722]；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24℃，濕度50%～60%。本實驗由醫(yī)院動物倫理委員會批準后進行。

1.2 藥 物 白楊素（原料藥，純度98%，臺州市博納化工有限公司，批號191027）；地塞米松（原料藥，純度99%，武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司，批號50-02-2）；戊巴比妥鈉（德國默克公司，批號DM5211）。

1.3 試劑及儀器 RIPA 緩沖液、化學發(fā)光檢測試劑盒（美國sigma 公司，批號S0914、S1073）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳膜（碧云天生物技術研究所，批號20181107、20190124）；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號R45685）；逆轉錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術北京有限公司，批號RA-1009）；SYBR Prime Script PLUS RT-RNA PCR試劑盒、聚偏氟乙烯膜（寶生物工程大連有限公司，批號B0647、B0826）；蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號PL0037）；抗p38 抗體、抗磷酸化MAPK（p-MAPK）抗體、抗β-actin 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗（美國Abcam 公司，批號ab0911、ab1065、ab0723、ab1258）；Vivid 7 Dimension型彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE 公司）；ZX-987型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；ABI7500 型實時PCR 檢測系統(tǒng)（賽默飛世爾科技中國有限公司）；E-Gel Imager 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 動物建模及分組 大鼠按隨機字母表法分成五組：對照組、模型組、地塞米松組（0.27mg/kg）[6]、白楊素低、高劑量組（20、40mg/kg）[7]，每組20 只。采用盲腸結扎穿孔術（CLP）建立膿毒癥模型大鼠：模型組、地塞米松組、白楊素低、高劑量組大鼠用戊巴比妥鈉（20mg/kg，腹膜內）麻醉，將腹部刮毛，消毒并切2cm的切口，隨后用無菌的3-0 絲線結扎盲腸，用18 號針頭刺穿1 次，擠壓盲腸以確保一部分糞便回到腹腔，最后，縫合腹腔并消毒[8]。對照組大鼠僅接受剖腹手術。術后6h，地塞米松組、白楊素低、高劑量組給予相應藥物灌胃，灌藥量1mL/100g，對照組及模型組給予等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥4 周。

2.2 超聲心功能指標測定 各組大鼠給藥結束后，應用彩色多普勒超聲診斷儀測定左心室舒張末期內徑（LVEDD）、短軸縮短分數（FS）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、射血分數（EF）。

2.3 大鼠心肌組織病理觀察 脫頸處死大鼠，獲取大鼠心肌組織，將心肌組織固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，在標準的脫水、二甲苯清除和石蠟包埋操作之后，使用旋轉式切片機切割切片（5μm 厚），去石蠟后，使用HE 染色試劑盒對組織切片進行染色。最后，使用光學顯微鏡觀察心肌組織病理學變化。

2.4 大鼠心肌組織p38、p-MAPK mRNA 表達水平測定 Trizol 試劑提取心肌組織總RNA，將總RNA通過逆轉錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Prime Script PLUS RT-RNA PCR 試劑盒進行實時PCR 分析，所有實驗重復3 次。實時熒光定量PCR（qRTPCR）在實時PCR 檢測系統(tǒng)進行，引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。使用的引物序列如下：p38 正向5'-GTCACTGTGAACGGATTTGGTCTCTTGAGTCGTATT-3'和p38 反向5'-CTGTGACTGAGTCTTCTGGGTGGCAGTGGGTGTGACAT -3'；p -MAPK正向5'-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCCTGTGACTGA-3' 和p-MAPK 反向5'-TATCTGCGGTTTCCTCAAGCGGGTGGCAGTGGGTGTGACATCTGTGACTGA -3'；GAPDH 正向5'-CAGGGAAAGCGAGTGGTTGGTAA-3' 和GAPDH 反向5'-TTACCAACCACTCGCTTTCCCTGTG-3'。GAPDH 用作內源對照。反應條件為95℃進行20s，在75℃進行30s，在60℃進行34s（共40 個循環(huán)）。總反應體系20μL 包括：正向引物和反向引物各2μL、dH2O 8μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ6μL、cDNA 2μL。使用2-ΔΔCt 方法計算p38、p-MAPK mRNA 相對表達水平。

2.5 大鼠心肌組織p38、p-MAPK 蛋白表達水平測定 使用含有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液中裂解心肌組織蛋白質，采用蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質濃度，將蛋白質通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂奶中封閉，并與抗p38 抗體（1∶1000稀釋），抗p-MAPK 抗體（1∶1000 稀釋），抗β-actin 抗體（1∶2000 稀釋）在4℃下孵育過夜。β-actin 用作內源對照。加入HRP 偶聯(lián)二抗（1∶1000 稀釋）在室溫下孵育2h。使用增強的化學發(fā)光檢測試劑盒對印跡進行顯影，并使用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描。實驗重復3 次。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 進行數據分析，計量數據以均數±標準差（）描述，采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 白楊素對膿毒癥大鼠心功能指標的影響 與對照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD 水平升高，F(xiàn)S、EF 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、白楊素低、高劑量組LVEDD、LVESD 水平降低，F(xiàn)S、EF 水平升高（P＜0.05）；白楊素高劑量組LVEDD、LVESD、FS、EF 水平較低劑量組改善更明顯，與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2 白楊素對膿毒癥大鼠心肌病理結構的改變 對照組心肌結構正常；模型組心肌邊界模糊，可見明顯炎癥細胞浸潤及壞死區(qū)域；地塞米松組及白楊素高劑量組心肌損傷明顯減輕，幾乎無炎癥細胞浸潤，心肌細胞壞死區(qū)域明顯減少；而白楊素低劑量組仍有明顯炎癥細胞浸潤，心肌細胞壞死區(qū)域與模型組比較略微減少。見圖1。

3.3 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠p38、p-MAPK mRNA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、白楊素低、高劑量組p38、p-MAPK mRNA 水平降低（P＜0.05）；白楊素高劑量組p38、p-MAPK mRNA 水平較低劑量組降低更明顯（P＜0.05），與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

3.4 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠p38、p-MAPK 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、白楊素低、高劑量組p38、p-MAPK 蛋白水平降低（P＜0.05）；白楊素高劑量組p38、p-MAPK 蛋白水平較低劑量組降低更明顯（P＜0.05），與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、圖2。

表1 白楊素對膿毒癥大鼠心功能指標的影響（）

表1 白楊素對膿毒癥大鼠心功能指標的影響（）

注：對照組給予生理鹽水灌胃；模型組給予生理鹽水灌胃；地塞米松組給予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白楊素低劑量組給予20mg/kg 白楊素灌胃；白楊素高劑量組給予40mg/kg 白楊素灌胃；LVEDD 為左心室舒張末期內徑；LVESD 為左心室收縮末期內徑；FS 為短軸縮短分數；EF 為射血分數；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與白楊素低劑量組比較，cP＜0.05

圖1 白楊素對膿毒癥大鼠心肌病理結構的影響（HE 染色×400）

表2 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影響（）

表2 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影響（）

注：對照組給予生理鹽水灌胃；模型組給予生理鹽水灌胃；地塞米松組給予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白楊素低劑量組給予20mg/kg 白楊素灌胃；白楊素高劑量組給予40mg/kg 白楊素灌胃；p-MAPK 為磷酸化有絲分裂原激活的蛋白激酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與白楊素低劑量組比較，cP＜0.05

4 討論

白楊素具有多種生物學活性，其抗炎作用已在實驗動物模型和臨床研究中報道。先前已證明白楊素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、無乳鏈球菌和多殺巴斯德氏菌具有抑制作用，并且其作用與濃度呈正相關[9]。此外，白楊素可通過抑制p38-MAPK 信號傳導途徑和TNF-α 的表達來減少急性肺損傷模型大鼠中油酸的產生[7]。通過調節(jié)脂多糖（LPS）識別受體的表達，白楊素能夠減少內毒素引起的小鼠病理性肺損傷[10]。白楊素在調節(jié)免疫反應，減少超敏反應以及抑制體內和體外組胺釋放方面具有積極的藥理作用[11]。已證明白楊素可通過下調巨噬細胞中Toll 樣受體4（TLR4）/核轉錄因子-κB（NFκB）來抑制LPS 誘導的炎癥。白楊素還對LPS 誘發(fā)的乳腺炎癥反應具有保護作用，其抗炎機制已被證明與NF-κB 和MAPK 信號通路的抑制有關[12]。研究表明，白楊素能夠改善心力衰竭大鼠的左心室肥大和功能障礙；阿魏酸鈉和白楊素的組合對小鼠的CLP 致死性敗血癥具有保護作用[7]。本研究結果顯示，地塞米松組、白楊素低、高劑量組LVEDD、LVESD 水平低于模型組，F(xiàn)S、EF 水平高于模型組（P＜0.05）。這與上述討論一致，同時說明，白楊素能提升膿毒癥大鼠心功能水平。結合病理學結果，地塞米松組及白楊素高劑量組心肌損傷明顯減輕，幾乎無炎癥細胞浸潤，心肌細胞壞死區(qū)域明顯減少。說明白楊素減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷可能與白楊素減輕心肌細胞炎癥反應有關。

表3 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影響（）

表3 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影響（）

注：對照組給予生理鹽水灌胃；模型組給予生理鹽水灌胃；地塞米松組給予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白楊素低劑量組給予20mg/kg 白楊素灌胃；白楊素高劑量組給予40mg/kg 白楊素灌胃；p-MAPK 為磷酸化有絲分裂原激活的蛋白激酶；對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與白楊素低劑量組比較，cP＜0.05

圖2 白楊素對膿毒癥大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影響

據報道，促炎介質的產生和釋放，p38-MAPK 途徑的激活在膿毒癥誘導的心肌細胞損傷中起重要作用[13]。Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活因子，NF-κB 和MAPK 在調節(jié)炎癥信號轉導中很重要。p38 是與免疫和炎癥反應相關的重要細胞轉錄因子，在上述細胞內信號傳導途徑的融合中具有核心地位[14]。在靜止狀態(tài)下，p38 蛋白與IκB 家族蛋白結合，以無活性形式存在于細胞質中。非活性p38 復合物和活性p38 在細胞質和細胞核之間處于動態(tài)平衡[15]。研究表明，對p38 的抑制導致結腸細胞系中IL-6 和IL-8 的生成減少；在炎癥性腸病的大鼠模型中，對p38 的抑制可顯著降低體內細胞因子mRNA 水平和NF-κB 激活[16]。p38 途徑激酶被認為是抗炎藥的靶標，這些選擇性抑制劑具有良好的藥理活性。p38-MAPK 的激活在敗血癥引起的心肌功能障礙和炎癥，以及引起的心肌功能障礙和炎癥中起關鍵作用[17]。本次研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松組、白楊素低劑量組、白楊素高劑量組p38、p-MAPK mRNA 和蛋白水平低于模型組，且白楊素高劑量組p38、p-MAPK mRNA 和蛋白低于低劑量組。這說明，p38、p-MAPK 磷酸化可導致心肌損傷加重；而白楊素可顯著抑制膿毒癥大鼠心肌細胞p38-MAPK 磷酸化。

綜上所述，白楊素能減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷，減輕心肌細胞炎癥反應；其機制可能與白楊素可顯著抑制膿毒癥大鼠心肌細胞p38-MAPK 磷酸化有關。