外周血PCA3基因mRNA檢測診斷前列腺癌臨床應用價值

湯山松 楊 霞

四川省資陽市人民醫院腫瘤科 641300

目前，PC常用的篩查方法為血清前列腺特異抗原檢查，但其體內水平個體差異較大。因此確定其診斷PC的cutt-off值較為困難且臨床應用特異性較低。PCA3為新近鑒定的在PC患者中特異高表達的癌基因[1]。有研究顯示，與正常人群相比，PCA3 mRNA在PC患者中表達水平呈現顯著升高[2-3]。因此，本研究探討外周血中PCA3 mRNA水平在PC診斷中的可行性，及其作為生物標志物的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象來源 選取2016年2月—2020年4月我院收治的確診PC患者24例(病例組)和良性前列腺增生(BPH)40例及泌尿系結石患者13例(對照組)作為研究對象。患者納入標準：患者年齡>50周歲；獲取患者標本前均需要簽署知情同意書；病理學或細胞學證實PC、BPH或泌尿系結石；PC患者為初診且既往未接受過治療。排除標準：患者無細胞學或病理學診斷；合并性傳播疾病；合并有其他系統惡性腫瘤；HIV陽性患者均予以排除。

1.2 試劑與儀器 Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄酶MMLV(購自大連寶生物，TAKARA公司)，核酶抑制劑RNAsin，dNTP，DEPC水(購自Tiangen公司)，PCR引物合成(由華大基因完成)，Taq酶，EX TaqTMR-PCR(購自大連寶生物，TAKARA公司)，實時熒光定量PCR儀(購自ABI公司)， 高速離心機(購自美國Beckman公司)，紫外凝膠成像系統(購自美國BIO-RAD公司)。

1.3 標本采集與處理 患者確診后，抽取靜脈血3ml，置入乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，并向采血管中加入Trizol試劑吹打混勻，-80℃保存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 總RNA提取：Trizol法提取總RNA[4]，取預先收集的外周血0.5ml置于無酶EP管中，向EP管中加入1ml Trizol，渦旋30s，26℃靜止6min，低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。吸取上層無色澄清液體置入另一無酶EP管中并加入200μl氯仿，劇烈震蕩10s，然后26℃放置5min，低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。轉移上次液體至另一離心管中并加入600μl異丙醇，充分震蕩后靜置10min。后低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。然后棄去上層清夜，保留EP管地步沉淀并加入1 000μl 75%的乙醇，充分混勻后8 000r/min，低溫離心4min。棄去上清，晾干后置于-80℃冰箱中保存。

1.4.2 實時熒光定量PCR反應：根據ABIPRISM 7900HT Fast Real-time PCR 儀器說明進行操作。PCA3基因上游引物5’-AGAAGCTGG CATCAGAAAAA-3’下游引物3’-TCCTGCCCATCCTTTAAGG-5’，反應體系見表1。

表1 PCA3基因Real-time PCR反應體系

1.5 統計學方法 PCA3 mRNA表達量計算，ΔCT=CTpca3-CTβ-actinPCA3mRNA相對表達量=2-ΔCT×10。 Stata 12.0統計軟件繪制ROC曲線，并根據敏感性和特異性的最佳組合判斷cutt-off值，并給出相應的該臨界值下診斷PC的敏感性和特異性，計算AUC，檢驗效能為α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCA3 mRNA表達水平 PC、BPH及泌尿系結石患者PCA3 mRNA水平分別為62.7±29.8、8.9±6.4和4.1±2.2，PC組顯著高于其他兩組患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 三組患者1PCA3基因mRNA表達水平比較

2.2 PCA3mRNA檢測診斷前列腺癌的價值 根據貝葉斯定理繪制ROC曲線并計算曲線下面積AUC=0.94，確定cut-off值為16.2，該cut-off值下診斷PC的敏感性為78.8%，特異性為95.8%，見圖2。

圖2 PCA3基因診斷前列腺癌的ROC曲線圖

3 討論

在西方國家PC的發病率較高，2013年美國PC新發病例為238 590例，PC發病率約占全身惡性腫瘤的28%，為發病率最高的惡性腫瘤，死亡人數為29 720例，占惡性腫瘤死亡人數的10%，為第二位[5]。與西方國家相比我國等東亞人群PC的發病率較低，但尚無確切流行病學數據[6]。臨床上，對PC高危人群進行篩查，早期發現腫瘤性病變是提高PC預后的重要方法[7]。前列腺解剖位置隱秘，臨床查體及影像學檢查等不易發現早期病變。近年來的研究顯示PCA3在PC患者呈現高表達，而在良性前列腺增生及正常人群中表達水平較低[8-9]，因此，PCA3有可能成為早期篩查PC的腫瘤標志物。PCA3基因是由約翰霍普金斯醫院的Baltimore和Nijmegen 共同發現的，該基因定位于人9號染色體21-22區全長約25kb，該基因由4個exon和3個introns組成[10]。國外文獻報道，PCA3基因mRNA在PC組織中拷貝數顯著上升[2]，同時亦有文獻報道，PC患者體液標本同樣可以檢測到拷貝數增加的mRNA水平[11]。這樣的結果提示，PCA3基因有可能成為診斷PC的生物學標志物。PCA3基因在PC與BPH患者體內呈現差異性表達，為其成為診斷PC的生物學標志物提供了可能；其次，在外周血或尿液中這種差異表達仍能檢測到，為采用微創或無創的方法篩查PC提供了方便條件。

國內劉龍亞等人[12]采用qPCR方法檢測PC及BPH患者外周血及前列腺按摩液中的PCA3基因表達水平，研究結果提示，PC患者外周血及前列腺液中PCA3表達水平顯著高于BPH患者，采用PCA3作為診斷標準，其診斷PC的敏感性為86.5%。在本研究中，PC組患者PCA3 mRNA表達水平顯著高于其他兩組患者(P<0.05)。根據貝葉斯定理計算的ROC曲線下面積AUC=0.94，cut-off值為16.2，該cut-off值下診斷PC的敏感性為78.8%，特異性為95.8%。提示PCA3基因mRNA檢測可作為PC患者有效診斷方法。

綜上所述，檢測PC高危人群外周血中PCA3 mRNA表達為篩查PC提供了可行性方法，其診斷的敏感性和特異性均較高。但本研究納入患者例數較少，且為單中心的臨床研究，同時各組人群納入及實驗過程中均未采用盲法，因而實驗結果可能受到信息偏倚等因素的影響。因此，在實驗條件、經濟條件允許的大型醫療中心應進一步進行多中心的前瞻性臨床研究，為PCA3檢測作為PC篩查的腫瘤標志物提供更為充分的臨床依據。