不同類型探針對免疫層析方法的分析靈敏度影響研究

馬嘉琪，姚曉琳，劉思杰，殷雪馳，畢鵬飛，王建龍，張道宏

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

免疫層析法具有操作簡單、快速、經濟、不依賴儀器和專業人員等獨特優勢[1-3]，廣泛用于臨床醫學[4-5]、環境監測[6-7]及食品安全[8-9]等領域的現場快速監測。信號探針是免疫層析方法中最重要的組成之一，也是影響方法靈敏度的最重要因素之一。對于小分子化合物的免疫層析檢測，采用競爭抑制原理。傳統的免疫層析方法中信號探針指的是納米材料標記的檢測抗體，但其靈敏度不高，這是因為：①傳統探針中，由于標記納米材料而產生的空間位阻效應阻礙了檢測抗體上部分抗原結合位點對抗原的結合作用，導致檢測抗體對樣品中游離小分子半抗原的濃度響應不夠靈敏；②在基于傳統探針的競爭抑制免疫層析分析中，分析反應的信號強度與所應用的檢測抗體濃度呈正相關，為獲得足夠的信號強度，檢測抗體的用量也隨之增加，不利于競爭反應的進行[10-11]；③與游離的抗體相比，標記了納米材料的抗體生物活性和布朗運動受到抑制[12]。免疫層析方法中用以提供信號的納米材料除最常用的膠體金[13-14]外，還有量子點[15-16]、磁性納米材料[17-18]、碳納米管[19]、石墨烯[20]、乳膠微球納米材料[21]和納米復合材料[22]等。與膠體金標記材料相比，磁性納米材料(Fe3O4)具有優異的光學性質[23]，還具有強烈磁性[24]，可進行磁性分離，且合成方法簡單，是一種理想的標記材料。

雌二醇是一種典型的天然雌性激素[25]，是環境內分泌干擾性物質的重要組成部分。17β-雌二醇(17β-Estradiol,17β-E2)是與動物繁殖相關最具活性的天然性激素之一，被廣泛用于畜禽養殖業以促進機體生長和提高生產性能[26]。但17β-雌二醇化學性質穩定，且在動物體內無特定的代謝系統，因此17β-雌二醇及其衍生物易通過食物鏈在生物體內蓄積。研究表明，從外界攝入過量的17β-雌二醇會使人體激素平衡發生紊亂[27]，導致兒童性早熟[28]，甚至影響女性生育并引發卵巢癌等疾病[29]，同時也會增加男性患前列腺癌的風險，嚴重威脅消費者健康。因此，研究建立一種食品中17β-雌二醇的快速檢測方法具有十分重要的意義。

本研究采用磁性納米材料分別標記檢測抗體和第二抗體，作為傳統探針和間接探針，又將傳統探針和間接探針按照一定比例組合成配對探針。為探究不同類型探針對免疫層析方法分析靈敏度的影響，以17β-雌二醇為檢測目標物，分別建立了基于此3種探針的17β-雌二醇的競爭免疫層析分析方法，比較了三者的檢測靈敏度，其中間接探針和配對探針的使用刷新了傳統方法中信號探針必須是信號材料標記檢測抗體所制備的認知，可為其他對靈敏度要求較高且追求簡單的免疫層析方法提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

17β-雌二醇標準品、孕酮標準品、睪酮標準品、雌酮標準品、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亞胺(EDC)、正羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購于Sigma-Aldrich化學試劑公司；牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)購自MP Biochina公司；17β-E2-BSA偶聯物購自龍巖生物有限公司；17β-雌二醇單克隆抗體(17β-E2-mAb)為實驗室自制；羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(pAb)購自洛陽寶通實驗材料中心；醋酸鈉、二水合檸檬酸三鈉、四硼酸鈉、蔗糖和六水合三氯化鐵購自國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇購自成都科隆化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Vetex70傅里葉變換近紅外光譜儀(德國布魯克公司)；JEM-1230透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；HGS510-2-D點膜儀(杭州峰航科技有限公司)；HGS-201切條機(杭州峰航科技有限公司)；DGG-9030B電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信儀器公司)；EOS M2Canon數碼相機(日本佳能公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；JT-D高速組織均質機(漯河市金田試驗設備研究所)；VORTEX GENIUS 3渦旋振蕩器(德國IKA公司)。

1.2 Fe3O4磁性納米材料(MNPs)的合成

采用一步水熱法合成帶有羧基的水溶性Fe3O4磁性納米材料(MNPs)，具體合成過程如下：將0.675 g的六水合三氯化鐵和0.245 g二水合檸檬酸三鈉溶于20 mL乙二醇中，磁力攪拌1 h，再加入1.2 g醋酸鈉繼續攪拌30 min，隨后將混合物轉入反應釜并置于200 ℃烘箱中加熱10 h，待反應釜自然降溫后打開，所得混合物用無水乙醇和超純水分別清洗3次，最后放入60 ℃真空干燥箱中干燥，獲得的棕色產物即為合成的MNPs，收集至離心管中，密封備用。

1.3 Fe3O4標記探針的制備

首先采用間接ELISA和間接競爭ELISA鑒定抗體的分析性能，然后采用EDC/NHS交聯法將17β-E2-mAb和羊抗鼠pAb分別修飾在MNPs上。將MNPs材料用蒸餾水稀釋成1 mg/mL的棕黃色溶液，按照每1 mL MNPs材料中加入1 mg EDC和0.6 g NHS的比例對MNPs進行活化，渦旋溶解，在37 ℃下于220 r/min搖床中孵育30 min。磁性分離活化的MNPs，用硼酸緩沖液清洗，除去多余的EDC和NHS。用0.02 mol/L硼酸溶液(pH 6.6)重懸清洗后的功能化MNPs材料。然后加入1 mg/mL的抗17β-E2單克隆抗體或羊抗鼠多克隆抗體溶液，將混合物在 37 ℃下孵育1 h，磁性分離，去除上清液。在磁性標記物中加入1 mL含1%BSA的pH 6.6硼酸緩沖液，37 ℃反應1 h，對MNPs表面的空余位點進行封閉。將封閉好的磁性納米探針用硼酸緩沖溶液洗滌2次，再用含5%蔗糖、1% BSA的硼酸緩沖液重懸至原體積的1/10，置于4 ℃冰箱中備用。其中，MNPs標記的抗17β-E2單克隆抗體為傳統探針，MNPs標記的羊抗鼠多克隆抗體為間接探針，由兩者組成的混合探針為配對探針。

1.4 免疫層析試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜(NC膜)和吸水墊組成，制備過程如下：首先將樣品墊在封閉緩沖液中完全浸濕，于37 ℃下干燥過夜;再利用點膜儀將0.5 mg/mL的抗原17β-E2-BSA和1 mg/mL的羊抗鼠多克隆抗體溶液以0.5 μL/cm的速率分別均勻噴劃在NC膜上，形成檢測線(T線)和質控線(C線)，室溫下干燥30 min;之后將NC膜、樣品墊和吸水墊依次貼至襯板上，不同部位之間互相重疊約2 mm，最后用切條機切成3 mm寬的試紙條，保存于干燥環境中備用。

1.5 不同探針類型的免疫層析方法分析性能鑒定

將17β-E2標準品用DMSO溶解并稀釋至100 μg/mL作為儲備液，再用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)將儲備液分別稀釋成0.1～40 ng/mL系列質量濃度的待檢溶液，每種免疫層析方法7個濃度，并以PBS為陰性空白對照。7個濃度樣品溶液分別取100 μL加入1.5 mL PE管中，再加入適量傳統探針溶液或抗17β-E2單克隆抗體及間接探針溶液或配對探針溶液，混合均勻，滴加至試紙條樣品墊，免疫層析反應10 min后肉眼觀察結果。每個濃度重復3次，最后對試紙條進行拍照記錄，采用ImageJ軟件分析T線的光密度值。

1.6 食品中17β-雌二醇的免疫層析檢測

采用雞肉和牛奶樣品的添加回收實驗對所建立的3種免疫層析法進行評估，首先進行樣品前處理。雞肉樣品：取空白樣品用高速組織均質機攪碎，精密稱取1.0 g均質的雞肉樣品于9個離心管中，標記序號為0～8#，各其中添加適量17β-雌二醇標準溶液并使之終濃度為0.2、0.4、1、2、4、10、16、20 ng/g。在0#離心管中加入相同體積的PBS對照品溶液，渦旋，充分混勻，將9個離心管于4 ℃放置過夜。次日，分別在9個離心管中加入2 mL PBS，渦旋，充分與樣品混合，超聲5 min，于10 000 r/min離心5 min，收集上清液，待測。

牛奶樣品：取18 mL牛奶于4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min，去除上層脂肪。取5 mL脫脂牛奶，加等體積PBS溶液稀釋至10 mL，將稀釋好的牛奶樣品加入9個離心管中，每管1 mL，分別添加適量17β-雌二醇標準溶液，使其在牛奶中的終濃度為0.4、0.8、2、4、8、20、32、40 ng/mL，充分渦旋混勻，靜置2 h，作為待檢溶液。分別取100 μL雞肉和牛奶待檢溶液加入1.5 mL離心管中，將所選出的最佳17β-雌二醇試紙條插入混合溶液中，反應10 min，肉眼觀察結果。每個濃度重復3次，最后對試紙條進行拍照記錄。

2 結果與討論

2.1 MNPs的合成鑒定

本研究所采用的MNPs標記材料為羧基化的Fe3O4，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察MNPs形貌(圖1A)，并采用傅里葉變換近紅外光譜儀對其進行紅外光譜掃描(圖1B)。結果顯示，制備的MNPs呈現粒徑較均一的單分散球形，形貌較好；在540 cm-1處觀察到Fe—O峰，在 1 654 cm-1和1 384 cm-1處的特征峰為羧基拉伸振動所致[30]，3 377 cm-1處為—OH的特征峰[31]。表明羧基化的Fe3O4納米材料合成成功，且穩定性較好。

2.2 抗17β-雌二醇抗體的性能分析

將17β-E2-BSA完全抗原包被在酶標板上，采用競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)對不同質量濃度(0、0.05、0.15、0.5、1、2 ng/mL)17β-雌二醇標準溶液進行分析，并繪制競爭抑制曲線，以半數抑制濃度(IC50)來表示競爭ELISA的檢測靈敏度。結果顯示，抗體對17β-雌二醇標準品的靈敏度可達0.168 ng/mL(R2=0.998 1)；為評估該抗體對17β-雌二醇檢測的特異性，以20～50倍17β-雌二醇濃度的雌激素類孕酮(PRG)、睪酮(T)和雌酮(E1)為干擾物，3種干擾物標準品均采用0、2.5、5、10、20、40 ng/mL 6個濃度，17β-E2采用0、0.05、0.15、0.5、1、2 ng/mL 6個濃度，與17β-E2-BSA開展競爭反應。結果顯示，抗體與3種高濃度雌激素干擾物基本不反應，交叉反應率均小于1%。因此，本研究中所用抗體對17β-雌二醇具有較高的靈敏度和特異性，作為核心試劑，高質量的抗體能夠為后續17β-雌二醇免疫層析方法的建立奠定堅實的材料基礎。

圖2 MNPs、傳統探針和間接探針的紫外掃描光譜圖

2.3 探針的合成鑒定

利用紫外可見吸收光譜對MNPs材料、傳統探針和間接探針進行表征(圖2)。結果顯示，單純的MNPs在紫外可見區域未見吸收峰，但結合了17β-E2-mAb和pAb的2種探針(MNP-mAb和MNP-pAb)在280 nm處均出現了吸收峰，由此證明，傳統探針和間接探針均已成功制備[32]。而配對探針由傳統探針和間接探針組成，采用同樣的標記方法，僅標記時的參數不同。

2.4 3種免疫層析分析方法的參數優化

實驗優化了傳統、配對和間接3種探針的主要參數，結果發現傳統探針中17β-E2-mAb的最佳標記量為7 μg/mL；配對探針由MNP-pAb和MNP-mAb組成，17β-E2-mAb和pAb的最佳標記量均為5 μg/mL；間接探針中pAb的最佳標記量為14 μg/mL。將MNPs標記的抗體溶液濃縮10倍后用于免疫層析分析，每根試紙條上探針的用量設為2 μL，其中配對探針中MNP-pAb和MNP-mAb的最佳配比為3∶7，即MNP-pAb和MNP-mAb的最佳用量分別是0.6 μL和1.4 μL?；趥鹘y探針、配對探針和間接探針的試紙條，每根試紙條上17β-E2-mAb的消耗量分別為140、70、10 ng，由此可見，基于配對探針和間接探針兩種新型探針的免疫層析方法對抗17β-E2單克隆抗體的消耗量明顯降低。小分子化合物的免疫層析檢測采用競爭原理，有限量的檢測抗體是競爭分析的核心要素，間接探針方法中對檢測抗體消耗量的降低，不僅能夠降低分析的成本，還有助于靈敏度的提高。

2.5 3種免疫層析方法的分析靈敏度

2.5.1 原理分析本研究設計的試紙條結構不同于傳統試紙條，僅由樣品墊、NC膜及吸水墊三部分組成(圖3A)，樣品溶液和探針或抗體的混合溶液作為檢測溶液，以弱陽性樣品為例，研究了傳統、間接、配對免疫層析試紙條的分析原理。由圖可見，檢測溶液滴加在傳統探針試紙條上后(圖3B)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與MNP-mAb傳統探針結合，當溶液層析至檢測線時，與小分子結合達到飽和的探針分子(MNP-mAb-17β-E2)由于不能再結合T線上的17β-E2-BSA抗原，繼續向前層析泳動，到達C線，與包被在其上的羊抗鼠多抗結合而被截留在C線上顯色；而未與游離17β-E2結合達到飽和或未與游離17β-E2結合的探針分子則在T線與固定在其上的17β-E2-BSA結合而被截留顯色。檢測溶液滴加在基于配對探針的試紙條上后(圖3C)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與MNP-mAb結合，同時由于mAb和羊抗鼠多抗的特異性結合作用，MNP-mAb與MNP-pAb結合，使得向前層析泳動的溶液中至少包含MNP-mAb-17β-E2、MNP-pAb-MNP-mAb-17β-E2、MNP-pAb-MNP-mAb 3種復合物，同樣的，與游離17β-E2小分子結合達到飽和的MNP-mAb-17β-E2或MNP-pAb-MNP-mAb-17β-E2復合物不能被T線截留，繼續向前泳動，在質控線處，因復合物中暴露在外的mAb被C線上的pAb結合，復合物被截留而顯色；而未與游離17β-E2達到飽和結合的復合物或未與游離17β-E2結合的MNP-mAb、MNP-pAb-MNP-mAb則與T線上的17β-E2-BSA結合顯色；在此過程中，由于一個MNP-mAb探針可以結合多個MNP-pAb，而暴露在外的MNP-pAb又可以再與其他的MNP-mAb探針結合，從而形成復雜的網絡結構，使得大量MNPs信號顆粒聚集，加深檢測線的顏色，起到了信號放大的作用。當檢測溶液滴加在基于間接探針的試紙條上時(圖3D)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與游離mAb結合，同時由于一抗二抗的特異性結合作用，mAb又與MNP-pAb結合，使得溶液中至少存在MNP-pAb-mAb-17β-E2、MNP-pAb-mAb 2種復合物，其中MNP-pAb-mAb被T線上的17β-E2-BSA結合顯色，而MNP-pAb-mAb-17β-E2復合物因不能再結合T線上的17β-E2-BSA，繼續向前泳動。由于所采用羊抗鼠多克隆抗體為“H+L”型混合物，既能結合mAb分子的重鏈(H鏈)，也能結合mAb分子的輕鏈(L鏈)，當MNP-pAb-mAb-17β-E2復合物溶液達到C線后，mAb分子上未被結合的重鏈或輕鏈被C線上的pAb結合，從而使得MNP-pAb-mAb-17β-E2截留在C線上顯色，在此過程中由于一個mAb可同時結合多個MNP-pAb探針，從而也具有信號放大作用。

圖3 試紙條結構(A)及傳統(B)、配對(C)、間接探針(D)免疫層析方法的分析原理示意圖

2.5.2 分析性能采用間接探針、配對探針和傳統探針3類試紙條分別對0～5、0～20、0～40 ng/mL的17β-E2標準溶液進行分析，以能夠使試紙條的T線顏色明顯比陰性對照淺時的最小17β-E2濃度作為可視化檢出限(Visual limit of detection,vLOD)，以能夠使試紙條T線顏色完全消失時的最小17β-E2濃度為視覺截止值(Visual cut-off)，結果見圖4。由圖可見，間接探針、配對探針、傳統探針3種免疫層析方法的vLOD分別為0.2、0.5、1 ng/mL，視覺截止值分別為5、10、30 ng/mL。另外，基于間接探針和配對探針的免疫層析方法，在0～0.5 ng/mL范圍內，其檢測線的光學強度值與17β-雌二醇的濃度成反比，其相關系數和線性關系方程式見圖4B和4D；對于基于傳統探針的免疫層析方法，在0～1 ng/mL范圍內，其檢測線的光學強度值與17β-雌二醇的濃度成反比，相關系數和線性關系方程式見圖4F。通過比較檢出限可知，基于間接探針的免疫層析方法靈敏度最高，而基于傳統探針的免疫層析方法靈敏度最低。另外，在競爭免疫分析中，檢測抗體的使用量直接影響分析的靈敏度，抗體用量越少，則游離小分子目標物和固向化抗原對抗體分子上有限抗原結合位點的競爭越激烈，方法對目標化合物濃度的響應敏感度也越高，此結果與“2.4”所述抗17β-E2單克隆抗體的消耗量完全對應。配對探針比傳統探針的靈敏度提高主要歸因于兩個方面：①由于一抗和二抗的結合作用，以及一個MNPs顆粒上能同時結合多個抗體，MNP-pAb、MNP-mAb兩個探針互相結合形成網絡結構，具有信號放大作用；②達到同樣的信號強度，配對探針相比僅靠MNP-mAb提供信號的傳統探針，能夠降低MNP-mAb的用量，相應的降低檢測抗體用量，激發更激烈的競爭反應。間接探針相比配對探針靈敏度的提高主要原因歸因于mAb是游離的抗體分子，而游離抗體分子的使用至少有兩個優勢：①避免了因標記MNPs顆粒所帶來的位阻效應，使17β-E2分子能夠和mAb分子更好的結合；②在傳統探針和配對探針中，因一個MNP顆粒上能夠同時結合多個mAb分子，在檢測溶液未達到T線前，已與17β-E2結合但未達到飽和的MNP-mAb探針可繼續與T線上的17β-E2-BSA結合顯色，從而降低了17β-E2的競爭效率。而在間接探針方案中，由于mAb處于游離狀態，可最大程度地提高17β-E2的競爭效率，從而提高對17β-E2濃度的響應敏感性。其次，本研究采用的羊抗鼠多克隆抗體中既含有能結合mAb分子H鏈的pAb，也含有能結合mAb分子L鏈的pAb，一個mAb分子能同時結合多個MNP-pAb探針，使得間接探針亦具有一定的信號放大作用，顯著提高了分析的敏感性。由此可見，與傳統探針相比，配對探針更具優勢；而與配對探針相比，間接探針更具優勢，相應實驗結果與原理分析中的理論分析具有一致性。

圖4 基于間接(A、B)、配對(C、D)和傳統探針(E、F)免疫層析方法的分析靈敏度結果及性能分析

2.6 食品中17β-雌二醇的檢測

取100 μL處理好的雞肉和牛奶樣品溶液，采用間接探針免疫層析試紙條檢測。結果顯示，間接探針試紙條對牛奶和雞肉樣品檢測溶液中17β-雌二醇的檢出限分別為0.2 ng/mL和0.5 ng/g，與測定17β-雌二醇標準溶液的檢出限(0.2 ng/mL)相當或略高，這是因為食品中復雜的基質效應(如蛋白質、血紅蛋白、脂肪等)影響了試紙條的分析性能。經過換算，間接探針試紙條對牛奶和雞肉樣品中17β-雌二醇的檢出限分別為0.4 ng/mL和1.0 ng/g(圖5)，符合國家出入境檢驗檢疫行業標準SNT4892-2017[33]中對牛奶和雞肉中17β-雌二醇的檢出限要求(均為1.0 μg/kg，相當于1.0 ng/g)，且間接探針試紙條具有普適性，只需更換檢測抗體和目標物，即可將制備好的MNP-pAb探針應用于更多的檢測體系中。

圖5 間接探針免疫層析試紙條對牛奶(A)和雞肉(B)中17β-雌二醇的檢測結果

3 結 論

本研究采用磁性納米材料標記檢測抗體和第二抗體，制備了傳統、間接和配對3種不同類型的探針，分別建立了17β-E2的免疫層析快速檢測方法。結果顯示，基于間接探針的免疫層析方法對17β-E2的檢測靈敏度最高，其可視化檢出限達0.2 ng/mL。此外，相比傳統探針和配對探針，間接探針對檢測抗體的消耗量最低。間接探針不但能夠顯著降低分析成本，提高靈敏度，還具有普適性，只需更換檢測抗體和目標物，即可將制備好的MNP-pAb探針應用于更多的檢測體系中。因此，間接探針免疫層析方法將具有巨大的推廣潛力和應用前景。