固相萃取/液相色譜-質譜/質譜法測定山銀花中5種主要黃酮苷元的含量

史穎珠，侯建波，謝 文，姚濱濱，盛 濤，胡曉莉，張 輝

(1.浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；2.杭州海關技術中心，浙江 杭州 310016；3.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；4.浙江立德產品技術有限公司，浙江 杭州 310016)

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq,)、華南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或帶初開的花，并在夏初花開放前采收獲得。自《中國藥典》2005年版起，與金銀花進行區分。山銀花具有清熱解毒，疏散風熱的功效，可用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱[1]。研究發現其還具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗動脈粥樣硬化等作用[2-5]，在我國主要分布在長江以南的湖南、四川、廣東、貴州、廣西、云南等省區和長江以北的河南、山東、安徽和湖北等省份[6]。

山銀花的有效成分除了綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙外，還有黃酮類、揮發油類、有機酸類和三萜類化合物[7-10]。有研究人員通過HPLC-MS/MS、光譜技術測定和鑒別山銀花黃酮類、有機酸類和環烯醚萜類化合物的含量[11-13]，以及開展包含黃酮類化合物在內的指紋圖譜研究[14-16]。由于黃酮類化合物種類較多，在植物體內苷元可與糖類物質形成不同的苷而普遍存在[17-19]，且標準品較難獲取，目前除液相色譜-高分辨質譜法[20-22]，其他分析手段較難獲得更全面的信息。本文通過文獻調研篩選出山銀花中5種主要黃酮苷元及其對應的黃酮苷(槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素、黃芩素、蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆樹苷和黃芩苷)(化學結構式如圖1所示)，通過鹽酸水解，乙醇溶液提取，HLB固相萃取柱凈化，液相色譜-質譜/質譜法對苷元進行定量測定，從而建立了山銀花中槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黃芩素5種主要黃酮苷元含量的測定方法。該方法通過對黃酮苷元的檢測，可更為全面地反映出各苷元所代表的黃酮類化合物總量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000型三重四極桿串聯質譜儀(配電噴霧離子源ESI，美國AB公司)，1100型液相色譜儀(美國Agilent 公司)，Milli-Q Synergy 185超純水器(美國Millipore公司)，IKA MS3 Basic型渦旋器(德國IKA公司)，24孔固相萃取裝置(美國Supelco公司)，Heraeus Multifuge X1R型臺式離心機(美國Thermo 公司)，G&G JJ500型電子天平(中國雙杰公司)，Mettler AE260(瑞士Mettler Toledo公司)。

甲醇(色譜純，Tedia公司)、甲酸(質譜級，Scharlau公司)、乙腈(色譜純，Scharlau公司)、乙醇(分析純，華東醫藥股份有限公司)、鹽酸(優級醇，永華化學科技(江蘇)有限公司)、叔丁基對苯二酚(TBHQ，分析純，Aladdin公司)、L-(+)-抗壞血酸(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；CNW C18固相萃取柱(6 mL，500 mg，Anpel公司)，Waters C18固相萃取柱(6 mL，500 mg，Waters公司)，Waters HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg，Waters公司)，Biocomma HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg，Biocomma公司)；色譜柱：Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm，日本關東化學株式會社)和 Inertsil ODS-3(3 μm，4.6 mm×150 mm，日本島津公司)。

標準物質：槲皮素(純度96.4%，ChromaDex公司)，木犀草素(純度96.9%，ChromaDex公司)，山萘酚(純度95.5%，中國食品藥品檢定研究院)，芹菜素(純度98.5%，Bepure公司)，黃芩素(純度99.2%，ANPEL公司)，蘆丁(純度95.0%，TRC公司)，木犀草苷(純度98.9%，ANPEL公司)，紫云英苷(純度99.1%，ANPEL公司)，野漆樹苷(純度98.9%，ANPEL公司)，黃芩苷(純度96.8%，ChromaDex公司)。用甲醇將各化合物標準品溶解，稀釋并定容獲得10 mg/mL的標準儲備液，根據需要用甲醇將儲備液稀釋至所需濃度。

圖1 5種主要黃酮苷元及其對應黃酮苷的化學結構式

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相：甲醇(A)-0.15%甲酸溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10.0 min，40%～75%A；10.0～15.0 min，75%～90%A；15.0～22.0 min，90%A；22.0～23.0 min，90%～40%A；23.0～30.0 min,40%A；流速：0.4 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫25 ℃。

1.2.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：負離子掃描；監測方式：多反應監測(MRM)；電噴霧電壓(IS)：-4 500 V；霧化氣壓力(GS1)：289 kPa(42 psi)；氣簾氣壓力(GS2)：310 kPa(45 psi)；輔助氣流速(CUR)：172 kPa(25 psi)；離子源溫度(TEM)：540 ℃；其它質譜參數如表1所示。

1.3 實驗方法

稱取0.5 g(精確至0.01 g)試樣置于150 mL圓底燒瓶中，加0.5 g TBHQ，36 mL 50%的乙醇溶液和4.0 mL濃鹽酸，在氮氣保護下，水浴加熱回流120 min，氮氣保護下冷卻后，加水定容至50 mL，取上清液1 mL，加入9 mL水，混勻并轉移至HLB固相萃取柱中(依次用5 mL甲醇和5 mL 5%甲醇溶液活化)，加入5 mL 10%甲醇溶液淋洗，抽干后，加10 mL甲醇進行洗脫，控制流速為1～2 mL/min，收集全部洗脫液，甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm有機濾膜，取1.0 mL定容溶液，加40%甲醇溶液稀釋定容至25 mL，混合均勻，供LC-MS/MS測定。

表1 各化合物的基本信息及質譜測定條件

2 結果與討論

2.1 水解與提取條件的選擇

浸提、超聲、回流等技術通常用于中草藥中有效成分的提取，參考中國藥典[1]的方法，實驗首先采用超聲方式進行提取，結果表明超聲環境下黃酮苷幾乎不發生水解反應。

對蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆樹苷和黃芩苷在不同含量乙醇溶液(30%、50%、70%)，鹽酸(5%、10%和12.5%)條件下，于氮氣保護下水浴加熱回流不同時間(30、60、90、120、180 min)進行實驗，同時對比TBHQ和抗壞血酸兩種不同抗氧化劑的保護情況。結果表明，在無抗氧化劑時，槲皮素、山萘酚和黃岑素的回收率低于50%。在抗壞血酸存在下，槲皮素、山萘酚和黃岑素的回收率無明顯提高，而加入TBHQ后，槲皮素、山萘酚、黃岑素的回收率可達70%以上。乙醇溶液的含量變化對結果無明顯影響，考慮到黃酮苷和苷元的溶解性差異，實驗選擇50%的乙醇進行實驗。在50%乙醇溶液中，當鹽酸濃度低于10%和水解時間小于120 min時，約20%的黃岑苷未水解。實驗最終確定的水解與提取條件為：采用10%鹽酸和50%乙醇溶液，在TBHQ和氮氣保護下水解120 min。在上述條件下對10 ng/mL黃酮苷元進行實驗，發現水解過程中各苷元的損失率均低于20%，有效保障了黃酮苷元的回收率。

圖2 不同固相萃取柱的凈化情況

2.2 凈化條件的選擇

考察了C18和HLB兩種類型固相萃取凈化柱對水解提取溶液的凈化情況，以降低基質效應對LC-MS/MS定量測定的背景干擾，提高檢測結果的準確性。實驗取1 mL 100 ng/mL的黃酮苷元標準溶液(50%乙醇溶液，含10%鹽酸和0.5 g TBHQ)，加入9 mL水，混勻并轉移至各固相萃取柱中，分別采取10 mL的10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液淋洗和甲醇洗脫。結果如圖2所示，50%甲醇溶液淋洗時，C18和HLB固相萃取柱中槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黃芩素均可以較好地被保留，甲醇洗脫回收率均大于65%，其中槲皮素和黃芩素在C18柱的凈化回收率比HLB柱的凈化回收率低5%～15%。Waters和Biocomma的HLB回收率無明顯差異，但由于黃芪素采用Waters HLB的凈化結果較好，且試驗中Waters HLB的穩定性更好。因此，實驗最終采用Waters HLB固相萃取柱開展方法學考察。

2.3 色譜條件的考察

對比了Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm)和 Inertsil ODS-3(3 μm，4.6 mm×150 mm)兩種色譜柱以甲醇或乙腈為有機相，0.15%甲酸溶液或水為水相時對目標化合物槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黃芩素5種黃酮苷元，及其對應的黃酮苷物質蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆樹苷和黃芩苷(質量濃度均為2 ng/mL)的分離情況。

研究表明，相同色譜條件下，黃芩苷在Mightysil RP-18柱中分離時譜峰峰形更好，且信號提升約4倍。在相同色譜柱和梯度洗脫程序下，甲醇為有機相時大部分化合物的響應信號和峰形優于乙腈(其中野漆樹苷、蘆丁、木犀草苷在甲醇為流動相時響應信號提升3～5倍)。在相同色譜柱下，以甲醇為有機相，對比了水和0.15%甲酸溶液為水相的分離情況，以Mightysil RP-18色譜柱為例，在0.15%甲酸溶液中信號的峰形和響應優于水(其中黃芩素提升約5倍)。

因此，實驗最終采用Mightysil RP-18為分離柱，甲醇為有機相，0.15%甲酸溶液為流動相。在該色譜條件下，分子離子峰相同的木犀草素和山萘酚，芹菜素和黃芩素，木犀草苷和紫云英苷可得到很好地分離(如圖3)。

圖3 液相色譜-質譜/質譜法對目標物(2 ng/mL)的分離結果

2.4 質譜條件的優化

對各黃酮苷和苷元的標準溶液分別進行稀釋，采用流動注射的方式在負離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子峰，再分別以待測化合物的分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描。按照歐盟EC/657指令和《質譜分析方法通則》的要求，選擇兩個特征子離子對目標化合物進行定量確證，以其中信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對。以多反應監測負離子模式優化各種質譜參數，獲得的最佳質譜條件見表1。

2.5 基質效應的考察

通過對比相同濃度的溶劑工作液(稀釋溶劑為流動相初始比例：甲醇-0.15%甲酸溶液，體積比4∶6)和經過前處理的基質加標溶液中各化合物的信號響應強度，計算離子抑制率[離子抑制率(%)=(溶劑工作液中響應強度-基質加標溶液響應強度)×100%/溶劑工作液中響應強度]以考察基質效應情況[23]。如表2所示，實驗條件下，配制質量濃度為4 ng/mL的溶劑工作液和基質加標溶液，得到各化合物定量離子對的離子抑制率均小于15%，即該條件下獲得的基質溶液無明顯基質效應。因此采用甲醇-0.15%甲酸溶液(體積比4∶6)配制工作溶液進行定量計算。

2.6 線性關系、定量下限及回收率

在優化實驗條件下，以待測物標準品的峰面積Y為縱坐標，以其含量X(g/kg)為橫坐標，考察了5種黃酮苷元含量分別為0、0.05、0.1、0.5、1 g/kg(采用40%甲醇溶液配制)時的線性關系。結果顯示，各化合物的線性范圍均為0～1.0 g/kg，相關系數(r2)大于0.995。方法的定量下限(以S/N=10計)為0.005 g/kg(槲皮素)，0.01 g/kg(木犀草素和芹菜素)和0.05 g/kg(山萘酚和黃芩素)。

表2 山銀花基質中各化合物的基質效應情況

在優化實驗條件下，對山銀花樣品進行檢測，測定樣品水解后含槲皮素0.17 g/kg、木犀草素0.19 g/kg、山萘酚0.06 g/kg、芹菜素0.05 g/kg和黃芩素0.09 g/kg。對樣品進行3個濃度水平的加標回收實驗，加入各黃酮苷(添加量相當于水解后槲皮素和木犀草素含量分別為0.10、0.20、0.40 g/kg，山萘酚、芹菜素和黃芩素含量分別為0.05、0.10、0.20 g/kg)，每個含量水平取6個平行樣，采用外標法定量。結果如表3所示，方法的平均回收率為70.4%～104%，相對標準偏差(RSD)為4.0%～12%。

表3 山銀花中5種黃酮苷元在3個加標水平下的回收率及相對標準偏差(n=6)

2.7 實際樣品的檢測

應用本方法對采購的13批山銀花樣品進行測定，結果如表4所示。在山銀花樣品中檢出的5種黃酮苷元中，木犀草素含量最高(0.112～0.453 g/kg)，其次是槲皮素(0.030～0.260 g/kg)和芹菜素(0.010～0.050 g/kg)，山萘酚和黃岑素的含量最低。

表4 山銀花樣品中的檢測結果

3 結 論

本文通過含有鹽酸的乙醇溶液水解山銀花中5種主要黃酮苷，并對其黃酮苷元進行提取，HLB固相萃取柱凈化，LC-MS/MS法檢測，外標法定量，實現了對山銀花中代表性黃酮苷(蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆樹苷和黃芩苷)的有效水解，及水解產物槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黃芩素含量的測定。該方法通過水解獲得山銀花中的黃酮苷元，并對其含量進行測定，可更準確地獲得山銀花中各主要黃酮類化合物含量的數據，對后續的含量分析以及藥物活性關系和品質研究，具有重要的輔助作用。