283例小兒腦脊液培養(yǎng)陽性病原菌分布和耐藥分析

張清秀,李 鎮(zhèn),李啟亮,周 為,甄景慧

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院 檢驗中心，北京100045)

化膿性腦膜炎是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病,發(fā)病率高、病情重，進展迅速，臨床上嚴重威脅患兒的生命，早期診斷和正確的抗感染尤其重要。腦脊液細菌培養(yǎng)和藥敏是診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的金標準，為臨床合理使用抗菌藥物，改善患兒的癥狀和預后提供重要依據(jù)。為了解北京兒童醫(yī)院門診及住院患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病情及耐藥情況，對2016-2018年腦脊液培養(yǎng)陽性結(jié)果進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2016年1月-2018年12月北京兒童醫(yī)院門急診和住院患兒送檢腦脊液陽性標本283株(同一患兒多次檢測同一菌株按一株計算)，其中95株為門急診患兒，未使用抗菌藥物即行腰穿送檢；188株來自住院患兒48小時后送檢的腦脊液培養(yǎng)。

1.2 分離培養(yǎng)臨床采用無菌技術(shù)采集腦脊液2-5 ml,置無菌容器中立即送檢。將送檢腦脊液分別接種于血平皿和不含萬古霉素的巧克力平皿，置35℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)過夜，18-24 h后觀察結(jié)果。或?qū)⒛X脊液注入兒童需氧、厭氧、真菌培養(yǎng)瓶，放入美國 Bactec全自動血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，待儀器報警后將標本轉(zhuǎn)種在血平皿、麥康凱平皿、巧克力平皿，孵育后取純菌進行儀器鑒定。

1.3 儀器鑒定與藥敏檢驗員按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第四版進行嚴格操作，挑取單個可疑菌落用全自動細菌鑒定儀對細菌進行鑒定。鑒定系統(tǒng)包括BD Phoenix100、Vitek2 Compact、MALDT-TOF質(zhì)譜儀等。藥敏試驗主要采用MIC(最小抑菌濃度)法，部分藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，結(jié)果判定依據(jù)2016版[1]美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)規(guī)定進行，耐甲氧西林葡萄球菌根據(jù)儀器的頭孢西丁篩選試驗結(jié)果判斷；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)確證試驗：將頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸貼在涂布待測菌的MH培養(yǎng)基上，35℃孵育18-24 h，任一組藥敏抑菌環(huán)≥5 mm,即為ESBL陽性。

1.4 統(tǒng)計方法全部數(shù)據(jù)采用WHONET5.6軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例表示，率采用百分比顯示。

2 結(jié)果

2.1 分離科室及年齡分布

2016-2018年自腦脊液標本中共分離出病原菌283株，其中門急診患兒分離菌95株，占33.6%；住院患兒分離菌188株，占66.4%。住院科室分布如下：感染內(nèi)科56株，占19.8%；兒童重癥監(jiān)護病房33株，占11.7%；新生兒內(nèi)科30株，占10.6%；新生兒重癥監(jiān)護病房26株，占9.2%；神經(jīng)外科26株，占9.2%；血液內(nèi)科6株，占2.1%；呼吸內(nèi)科5株，占1.8%；神經(jīng)內(nèi)科4株，占1.4%；新生兒外科1株，占0.4%；胸外科1株，占0.4%。

283株分離菌在各個年齡段的分布為：<1個月64株，占22.6%；1個月-12個月120株，占42.4%；1-6歲68株，占24.0%；>6歲31株，占11.0%。

2.2 腦脊液標本分離株的分布

283株分離菌中，革蘭陽性菌184株，占65.0%；革蘭陰性菌76株，占26.9%；真菌23株，占8.1%。常見革蘭陽性分離菌為凝固酶陰性葡萄球菌株(CNS)56株，占19.8%；肺炎鏈球菌44株，占15.5%；無乳鏈球菌33株，占11.7%；屎腸球菌17株，占6.0%；金黃色葡萄球菌14株，占4.9%。常見革蘭陰性分離菌為大腸埃希菌34株，占12.0%；肺炎克雷伯菌6株，占2.1%；陰溝腸桿菌5株，占1.8%；腦膜炎伊麗莎白菌3株，占1.0%；鮑曼不動桿菌3株，占1.1%；銅綠假單胞菌2株，占0.7%。常見真菌為白色念珠菌9株，占3.2%；新型隱球菌4株，占1.4%。

2016年分離82株，占29.0%；2017年分離94株，占33.2%；2018年分離107株，占37.8%；各年度分離病原菌的分布見表1所示。

2.3 革蘭陽性菌藥敏及耐藥情況

腦脊液陽性標本中，金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率92.9%，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)

表1 2016-2018年小兒腦脊液培養(yǎng)陽性常見病原菌的分布 (株)

的檢出率為35.7%；凝固酶陰性葡萄球菌對青霉素耐藥率80.4%，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)的檢出率為66.1%；屎腸球菌和肺炎鏈球菌對青霉素耐藥率分別為100%、75%；無乳鏈球菌對抗菌藥物均敏感；未檢出萬古霉素、利奈唑胺耐藥菌株，結(jié)果見表2。

2.4 革蘭陰性菌藥敏及耐藥情況

檢出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌20.6%(7/34)、肺炎克雷伯菌83.3%(5/6)；3株肺炎克雷伯菌對碳氫霉烯類耐藥、1株陰溝腸桿菌對碳氫霉烯類耐藥；銅綠假單胞菌對多數(shù)抗菌藥耐藥率高達50%以上；鮑曼不動桿菌多重耐藥嚴重，除多粘菌素、復方新諾明，均對其余抗菌藥耐藥率100%；腦膜炎伊麗莎白菌僅對復方新諾明敏感率100%。主要革蘭陰性桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率見表3。

3 討論

通過本次回顧性分析，2016-2018年臨床小兒腦脊液標本分離出病原菌283株，并且呈逐年上升趨勢，2018年達107株，分離率達37.8%(107/283)。以1-12個月嬰兒病原菌分離率最高42.4%(120/283)，6歲以上兒童分離最少11.0%(31/283)，符合化膿性腦膜炎的發(fā)病特點：2/3發(fā)生于2歲以內(nèi)小兒，6-12個月是發(fā)病高峰年齡。門急診患兒腦脊液分離病原菌95株，分離率33.6%(95/283)；其中肺炎鏈球菌檢出率最高11.0%(31/283)。國外研究肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌曾被認為是引起獲得性細菌性腦膜炎的主要致病菌，但由于流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌疫苗的廣泛應用，所致侵襲性感染率顯著降低[2]。本次研究，流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌的檢出率分別為1.4%(4/283)、0.4%(1/283)，這可能與苛養(yǎng)菌分離技術(shù)水平有限，以及分離菌大部分來源于醫(yī)院感染有關(guān)[3]。住院患兒腦脊液分離病原菌188株，分離率66.4%(188/283)，表皮葡萄球菌檢出率最高12.0%(34/283)。病房分布多來自感染較重、免疫力低下和年齡較小的科室，其中感染內(nèi)科檢出率最高19.8%(56/283)，其次是重癥監(jiān)護病房11.7%(33/283)，新生兒病房10.6%(30/283)。

表2 主要革蘭陽性球菌對常用抗菌藥物的耐藥情況(株%)

表3 主要革蘭陰性菌對常用抗菌藥物的耐藥情況(株%)

本研究顯示，革蘭陽性菌檢出率65.0%(184/283)，明顯高于革蘭陰性菌26.9%(76/283)，與CHINT等數(shù)據(jù)[3-5]接近。排在前五位的細菌依次是CNS、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌。有報道，CNS作為皮膚正常菌群，腦脊液中培養(yǎng)出的CNS 80%屬于污染[6]。無乳鏈球菌的分離來自急診患兒和重癥監(jiān)護病房，多為小于2個月的嬰兒。無乳鏈球菌是一種臨床常見的β溶血性鏈球菌，是發(fā)達國家新生兒和嬰兒血流感染的常見菌，造成化膿性腦膜炎和敗血癥病死率較高[7]。革蘭陰性菌分離率第一位是大腸埃希菌，分離率12.0%(34/283)，大多是2個月以內(nèi)的嬰兒，這與產(chǎn)婦生殖道內(nèi)存在大腸埃希菌的污染，因而在陰道分娩過程中，導致新生兒感染大腸埃希菌[8]；另外IgM對大腸埃希菌產(chǎn)生較強的殺傷力，但因胎盤屏障作用，孕婦的IgM并不能大量通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，也導致了新生兒先天就對大腸埃希菌缺乏免疫力[9]。多數(shù)報道[3-5]檢出第一位是鮑曼不動桿菌，分析原因可能是小兒與成人的區(qū)別，成人患者更多接受了侵入性操作和預防性用藥，尤其是術(shù)后增加了院內(nèi)感染的機會，本研究分離出3株鮑曼不動桿菌，不作為小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要細菌。

藥敏結(jié)果顯示，CNS和金黃色葡萄球菌對青霉素具有較高的耐藥率，MRCNS和MRSA的檢出率分別為66.1%、35.7%，MRSA的檢出率顯著低于CHINT數(shù)據(jù)分析[3]。屎腸球菌對氨芐西林、青霉素的耐藥率分別為94.1%、100%，糞腸球菌只分離一株，均敏感。葡萄球菌和腸球菌均未檢出萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株。藥敏結(jié)果顯示對苯唑西林敏感的菌株，可選用頭孢霉素和其他抗菌藥治療。肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥率高達75%，目前大量抗菌藥的使用，使其多重耐藥性日益加重[10]；此外對復方新諾明、頭孢吡肟具有較高的耐藥性，分別為56.8%、47.7%。在血清型分型中，肺炎鏈球菌在相對穩(wěn)定的遺傳背景上，容易接受外源基因，導致表型變化[11]。33株無乳鏈球菌對青霉素、萬古霉素、頭孢曲松敏感率100%,青霉素和頭孢菌素可作為治療無乳鏈球菌感染的首選藥物，與華春珍[12]等人的研究相同。

作為革蘭陰性菌常見的病原菌，大腸埃希菌在腦脊液中檢出率占第一位。檢出ESBL陽性20.6%(7/34)，對復方新諾明、氨芐西林的耐藥率分別是88.2%、44.1%，未發(fā)現(xiàn)對碳氫霉烯類耐藥菌株。肺炎克雷伯菌藥敏表現(xiàn)出高耐藥率，檢出ESBL陽性83.3%(5/6)，對碳氫霉烯類耐藥比例高達50%(3/6)，應引起重視。主要耐藥機制是廣譜β-內(nèi)酰胺酶群(ESBLs)的產(chǎn)生，產(chǎn)ESBLs菌株可發(fā)生克隆菌株的流行傳播，也可通過質(zhì)粒將產(chǎn)酶基因水平傳播給敏感的非產(chǎn)酶菌株，引起更多的細菌產(chǎn)生ESBLs，從而引起院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。其他革蘭陰性菌分離率較少，陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎伊麗莎白菌對碳氫霉烯類的耐藥率分別為20%、100%、50%、100%。鮑曼不動桿菌的多重耐藥比較嚴重，僅對多粘菌素敏感率100%，對復方新諾明敏感率33.3%。3株腦膜炎伊麗莎白菌對復方新諾明均敏感。銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌表現(xiàn)出對氨基糖甙類慶大霉素、阿米卡星均敏感，但其耳毒性、腎毒性副作用較大，阿米卡星可作為兒童用藥的添加劑，不能單獨使用。近年來，由于頭孢曲松、頭孢吡肟等第三代、第四代頭孢菌素在臨床廣泛應用，在兒科臨床上碳氫霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)的增多，給治療帶來困難，最佳治療方案是應選擇≥2種體外有效的抗菌藥聯(lián)合治療[13]。

此外分離出單核細胞增生李斯特菌9株(無藥敏)。腦膜炎奈瑟菌4株，對頭孢曲松、美羅培南敏感率100%；對阿奇霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、復方新諾明耐藥率分別為25%、100%、50%、100%。本研究分離出白色念珠菌9株(3.2%)、新型隱球菌4株(1.4%)，藥敏結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。治療方面，靜滴二性霉素B大量時會出現(xiàn)嚴重的腎功能損害，氟康唑不良反應小，在腦脊液及腦組織中濃度很高，可與二性霉素B聯(lián)合協(xié)同作用，提高治愈率[14]。此外還分離出兩例曲霉感染，構(gòu)巢曲霉和黑曲霉，中樞神經(jīng)系統(tǒng)曲霉病相對少見，腦脊液分離率低，易感因素包括造血干細胞移植、血液腫瘤化療、骨髓衰竭綜合征、長期大劑量激素治療等；治療方面推薦伏立康唑，如不耐受，可選用兩性霉素B脂質(zhì)體。

通過研究得出結(jié)論，小兒腦脊液分離培養(yǎng)以革蘭陽性細菌為主，革蘭陰性細菌、真菌分離較少，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染臨床的診斷治療提供依據(jù)。1個月-12個月嬰兒是細菌性腦膜炎感染的高危人群。腦脊液病原菌培養(yǎng)和藥敏顯示，對抗菌藥物耐藥率較高，應引起臨床的特別關(guān)注，嚴格無菌操作，控制院感，加強對產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥性監(jiān)測。