丙泊酚麻醉對老齡大鼠認知功能和海馬神經元γ-氨基丁酸A受體表達的影響

邱 潔,孫 虎,謝 爽,張彩彩,陳 磊

(海南醫學院第二附屬醫院 麻醉科，海南 海口，570311)

丙泊酚是常用麻醉藥之一，但會引起一些不良反應[1]。麻醉劑與患者手術后認知障礙(POCD)密切相關。研究[2-3]表明，丙泊酚可通過磷酸化海馬區Tau蛋白誘導POCD的發生。目前，丙泊酚導致認知功能障礙的機制尚不清楚，有學者[4]認為海馬神經元γ-氨基丁酸A(GABA)受體與認知功能關系密切。本研究觀察丙泊酚麻醉對老齡大鼠認知功能和海馬GABA受體的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取50只清潔級Wista大鼠，鼠齡20～22月齡，體質量360～420 g,雌雄不限，由長沙市天勤生物技術有限公司生產提供，許可證號為SCXK(湘)2014-0011,使用許可證號為SYXK(湘)2014-006。動物處理及實驗過程得到海南醫學院動物關懷及使用委員會的許可(IACUC0023)。實驗研究過程中嚴格遵守3R原則。

1.2 主要儀器及試劑

呼吸麻醉機(武漢醫用儀表有限公司)，呼吸監護儀(Datex Engstorm儀器公司，芬蘭)。商用體溫傳感器(Philips公司，德國)，嚙齒動物脈搏血氧計和心率監測儀(Datex Engstorm儀器公司，芬蘭)。

RPMI-1640培養液、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，兔抗鼠GABA單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(Sigma公司，美國);丙泊酚(批號090822,河北九派制藥有限公司);酶標儀SpectraMax M5P[上海美谷分子儀器(上海)有限公司]，倒置相差顯微鏡(上海蒼茂實業有限公司)，低溫高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司),SDS-PAGE凝膠電泳及轉移裝置(上海優寧維生物科技股份有限公司),LAS400凝膠成像系統(GE公司，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理:所有實驗動物在動物房進行適應性飼養1周。50只大鼠隨機分為丙泊酚組與對照組，每組25只。丙泊酚組大鼠腹腔注射1%丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液6 mL/kg,對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。所有注射藥物密封信封內，操作人員隨機分配。將大鼠放入麻醉箱，置于37 ℃環境中連接麻醉機，以混有30%氧氣的空氧混合氣體作為載體氣體，通氣流速(mL/min)=0.65×體質量(g)。

1.3.2 生命體征記錄:記錄每只大鼠直腸溫度、心率、呼吸頻率和血氧飽和度(SpO2)。采用商用體溫傳感器測定大鼠直腸溫度。使用嚙齒動物脈搏血氧計和心率監測儀評估心率和SpO2。通過計數大鼠的胸部運動的次數來記錄呼吸速率。麻醉開始后，大鼠被放置在恒溫毯上以保持各項參數的穩定。

1.3.3 認知功能檢測:實驗完畢后選取15只大鼠，清醒后繼續飼養48 h,實施Morris水迷宮實驗。迷宮按照順時針分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ部分。水池和平臺黑色，平臺放置于第Ⅱ部分。池水染成黑色，溫度保持在26 ℃,開啟設備。軟件自動記錄大鼠活動行跡，逃逸潛伏期定義為下水至找到平臺的時間，游泳路程定義為總里程，實驗進行5 d。實驗結束后的第2天移除平臺，大鼠從Ⅰ部分下水，記錄大鼠120 s內穿越平臺區域次數和時間。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色(HE)及尼式染色:實驗完畢后，解剖出腦海馬組織，制備石蠟切片(10 μm),脫蠟、脫水，尼氏染色液染色，蒸餾水洗滌，脫水。光學顯微鏡下觀察神經細胞形態及尼氏體。

1.3.5 Western Blot檢測GABA蛋白量表達:實驗完畢后1 d選取6只大鼠，解剖出腦海馬組織，加入2 mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min,40 ℃下500×g離心5 min,吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL待測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h,逐次兔抗鼠GABA單克隆抗體、HRP標記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像,Image Lab Software測定光密度，結果以目標蛋白與參照蛋白條帶比值表示相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 2組生命體征比較

2組麻醉開始時肛溫、心率、呼吸頻率、SPO2比較，差異無統計學意義(P>0.05)。麻醉后,2組大鼠肛溫、心率、呼吸頻率、SPO2均呈現一定程度的下降，而后逐漸恢復平穩，但2組各時間點上述指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

A:SPO2變化;B:呼吸頻率變化;C:肛溫變化;D:心率變化。

2.2 丙泊酚對大鼠水迷宮實驗逃逸潛伏期的影響

隨著實驗時間的延長,2組大鼠逃逸潛伏期、總里程數逐漸減小，丙泊酚組大鼠各時間點逃逸潛伏期、總里程均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 2組大鼠不同時間點逃逸潛伏期比較 s

表2 2組大鼠不同時間點總里程比較 m

2.3 丙泊酚對大鼠穿越平臺區域次數和時間的影響

丙泊酚組大鼠穿越平臺區域次數、時間分別為(3.09±0.42)次、(17.15±1.36) s,對照組大鼠穿越平臺區域次數、時間分別為(8.36±1.03)次、(39.02±4.73) s,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 2組大鼠海馬CAI區HE染色及尼式染色

對照組海馬區Nissl體存在于細胞漿及樹突，染色較深，神經細胞排列整齊，形態規則;丙泊酚組Nissl體消失，神經細胞數量減少，細胞核破裂、丟失。見圖2。

A:丙泊酚組大部分Nissl體在神經細胞中消失(箭頭1),神經細胞核丟失(箭頭2);B:對照組神經細胞胞漿內的Nissl體。

2.5 丙泊酚對大鼠海馬GABA蛋白的影響

丙泊酚組大鼠海馬GABA蛋白表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

丙泊酚屬于臨床常用的靜脈麻醉劑，具有起效快、蘇醒時間短、副作用小等優勢[5]。丙泊酚可以抑制海馬CAI區細胞突觸的長時程增強，引發POCD[6]。本實驗對大鼠進行了腹腔注射丙泊酚，觀察大鼠的認知功能，結果表明，丙泊酚組大鼠各時間點逃逸潛伏期、總里程均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05);隨著實驗時間的延長,2組大鼠逃逸潛伏期、總里程數逐漸減小，丙泊酚組大鼠穿越平臺區域次數、時間低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05),表明丙泊酚對大鼠認知功能具有一定的干擾。

研究[7-8]認為，丙泊酚可激活GABA，抑制神經細胞的信號傳導，導致認知功能障礙，出現順行性和逆行性遺忘等表現。GABA是海馬區中重要的抑制性神經遞質，研究[9-10]發現，阿爾茲海默病、帕金森綜合征等疾病海馬區域存在GABA低表達或GABA能受損。研究[11]發現，海馬區域中的GABA受體與認知功能有潛在的聯系。研究[12]表明，老年癡呆患者及輕度認知障礙患者GABA水平明顯降低。本研究觀察丙泊酚麻醉后大鼠海馬區域GABA受體蛋白的表達，結果表明，丙泊酚組大鼠海馬GABA蛋白表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05),提示GABA受體與丙泊酚誘導的認知功能障礙有一定的聯系。

Nissl體正常存在于神經元胞體和樹突中，參與蛋白質合成。神經元胞體內Nissl體大量存在表明神經元合成蛋白質的功能較強;反之，神經元功能存在障礙時,Nissl體減少或消失。研究[13]表明，人記憶功能與海馬部分蛋白質分泌、突觸間信號傳遞相關。本研究結果顯示，丙泊酚組大鼠海馬區神經元、Nissl體受損，考慮丙泊酚導致的認知障礙可能與Nissl體功能障礙相關。

綜上所述，丙泊酚麻醉對大鼠認知功能具有一定的影響，可能與海馬區GABA受體的表達有關，其具體機制仍待進一步研究證實。