響應面法優化新疆阿魏中阿魏酸的提取工藝及其抑制酪氨酸酶活性研究

阿迪拉·吐爾遜塔依，田永芝，何詩冰，努爾亞·艾尼外爾，范琳惠，約日耶提·薩力，塔吉古麗·阿不里克木

(新疆師范大學生命科學學院 新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室 干旱區植物逆境生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

阿魏屬于阿魏屬(FerulaL.)，歸類為傘形科(Umbelliferae)、芹亞科 (Apioideae)、前胡族(Peucedaneae)、阿魏亞族(Femlinae)。阿魏屬植物大多分布于內陸干旱、荒漠地區[1]，是多年生一次結果的草本。全世界約有150 余種，主要分布在歐洲南部地中海地區以及中亞鄰近地區。我國約有26種，1個變種，分布在東北、山西、西藏、云南、江蘇和新疆等地區；其中，產于新疆的有20種，主要分布在伊寧、阜康、托里、塔城、烏恰等地區。不同種類的阿魏屬植物生長的土壤類型有所不同，如新疆阿魏生長在灰鈣土上，阜康阿魏生長在荒漠灰鈣土上[2]。

阿魏屬植物的主要化學活性成分包括倍半萜、香豆素和多硫化合物等[3]。阿魏具有解毒、抗炎、抗過敏、抗高血壓等功效，對血液循環、神經、免疫系統都有影響[4]。早在古波斯就已將阿魏屬植物作為藥材[5]。國務院發布的“野生藥材資源保護管理條例”中，新疆阿魏被列為二級保護重要野生藥材物種[6]。阿魏酸(圖1)最初發現于阿魏植物的種子和葉子中，是一種廣泛存在于植物體內的酚酸，化學名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一[7]。阿魏酸微溶于冷水，可溶于熱水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，稍溶于乙醚，難溶于苯，且pH 值穩定性好。阿魏酸見光易分解，具有較強的抗氧化性[5]。

圖1 阿魏酸的化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of ferulic acid

新疆阿魏中含有的阿魏酸具有抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抑菌消炎、抑制血小板聚集及廣譜的抗變態反應的作用。阿魏酸安全無毒，具有良好的藥理作用和生物活性，在醫藥、保健品、化妝品原料等方面有較高的應用價值[8]。阿魏酸在中藥阿魏、升麻、當歸、酸棗仁等中含量較高，是其有效成分之一[9]。植物細胞壁是阿魏酸的重要來源，阿魏酸在細胞中與木質素和纖維素發生酯化，主要通過酯鍵與多糖和木質素交聯，利用酶法進行水解，可以斷裂酯鍵將阿魏酸釋放出來[10]。目前，從植物中提取阿魏酸的方法很多，主要有超臨界流體萃取法、微波提取法、超聲波提取法等[11]。與其它提取方法相比，超聲波輔助法具有提取效率高、提取時間短、操作簡單、能耗低等優點，具有較高的推廣和使用價值[12]。

研究[13]表明，阿魏酸分子易透過皮膚，直接作用于病變部位，在充分闡釋其作用機制的基礎上，有望將阿魏酸開發成功效型化妝品，用于色素性皮膚病的預防或治療[14]。阿魏酸對酪氨酸酶的抑制活性為天然安全的美白劑開發和食品保鮮技術如延緩果蔬、飲料類褐變提供了理論基礎[15]。鑒于此，作者以阿魏酸提取率為指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化新疆阿魏中阿魏酸的超聲波輔助酶法提取工藝，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法評價阿魏酸抑制酪氨酸酶活性，擬為阿魏酸的有效提取及其活性研究提供參考依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏，于2017年12月采自新疆伊犁。

阿魏酸標準品；木聚糖酶；無水乙醇；實驗用水為蒸餾水。

KQ-500B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；臺式低速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV2800型紫外分光光度計；恒溫水浴鍋。

1.2 阿魏酸的提取及阿魏酸效應組分的制備

將新疆阿魏的根莖粉碎成粉后晾干。精確稱取阿魏粉末2.00 g，按一定料液比加入60%乙醇溶液，置于超聲功率為500 W、超聲頻率為 40 kHz 的超聲波清洗儀中，在一定提取溫度下提取一定時間；加入適量的木聚糖酶，置于50 ℃水浴鍋中酶解45 min后，于100 ℃沸水浴滅酶 5 min；過濾，濾液倒入EP管中，3 000 r·min-1離心 8 min，上清液即為阿魏酸提取液。

將最佳條件下提取的阿魏酸提取液經大孔吸附樹脂分離后，用乙醇梯度洗脫，得到阿魏酸效應組分，此組分中阿魏酸含量達到49.59%。

1.3 阿魏酸提取率的測定

1.3.1 檢測波長的確定

以60%乙醇溶液作為空白對照，對阿魏酸標準溶液進行全波長掃描。結果發現，阿魏酸在323 nm處有最大特征吸收峰。因此，以323 nm作為檢測波長。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取阿魏酸標準品2.3 mg，用1 mL 60%乙醇溶液溶解，配制濃度分別為46 mg·L-1、23 mg·L-1、11.5 mg·L-1、5.75 mg·L-1、2.875 mg·L-1的阿魏酸標準溶液，測定323 nm處吸光度。以阿魏酸濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：A=0.0512c+0.1807，R2=0.9976。

1.3.3 阿魏酸提取率的計算

吸取0.5 mL阿魏酸提取液，用60%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，測定323 nm處吸光度，進行3次重復實驗，吸光度取平均值。根據標準曲線方程計算阿魏酸濃度，按式(1)計算阿魏酸提取率。

(1)

式中：c為提取液中阿魏酸濃度，mg·L-1；V為提取液體積，L；n為稀釋倍數；m為阿魏粉末質量，mg。

1.4 提取工藝優化

1.4.1 單因素實驗

稱取阿魏粉末2.00 g，分別考察料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，g∶mL，下同)、提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min)、提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、酶加量(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)對阿魏酸提取率的影響，每組實驗重復3次，取平均值。

1.4.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，設計4因素3水平的響應面實驗，因素與水平見表1。

表1 響應面實驗的因素與水平

1.5 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應組分對酪氨酸酶的抑制活性

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法測定阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。在96孔培養板中進行反應，總反應體系200 μL：2.5 mmol·L-1DL-Dopa[左旋多巴(DL-β-3，4-Dopa)]40 μL；25 U·mL-1酪氨酸酶40 μL；測試藥物40 μL；67.0 mmol·L-1PBS緩沖液80 μL。調零孔僅加67.0 mmol·L-1PBS緩沖液200 μL。將96孔培養板置于37 ℃水浴箱中孵育20 min，采用酶聯免疫檢測儀測定每孔溶液在490 nm處吸光度(A490)，每組實驗重復測試8次。按式(2)計算酪氨酸酶活性。

(2)

式中：A為加酶不加藥反應體系的A490值；A1為未加酶及藥反應體系的A490值；A2為同時加入酶及藥反應體系的A490值；A3為只加藥不加酶反應體系的A490值。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對阿魏酸提取率的影響

在提取溫度為 50 ℃、提取時間為 20 min、酶加量為 1.0%的條件下，考察料液比對阿魏酸提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對阿魏酸提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ferulic acid

從圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，阿魏酸提取率逐漸升高，當料液比為1∶12時，提取率達到最高；隨后提取率稍微下降。因此，料液比選擇1∶12較為適宜。

2.1.2 提取時間對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶10、提取溫度為50 ℃、酶加量為1.0%的條件下，考察提取時間對阿魏酸提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 提取時間對阿魏酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of ferulic acid

從圖3可知，當提取時間由10 min延長至20 min時，阿魏酸提取率快速升高；但繼續延長提取時間，阿魏酸提取率反而下降。這可能是由于，提取時間過長會破壞阿魏酸的內部結構，導致提取率下降。因此，提取時間選擇20 min較為適宜。

2.1.3 提取溫度對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶12、提取時間為20 min、酶加量為1.0%的條件下，考察提取溫度對阿魏酸提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對阿魏酸提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of ferulic acid

從圖4可知，隨著提取溫度的升高，阿魏酸提取率先升高后降低；當提取溫度為 50 ℃時，提取率達到最高。這可能是因為，提取溫度過高，阿魏酸結構可能被破壞或者使植物組織軟化。因此，提取溫度選擇50 ℃較為適宜。

2.1.4 酶加量對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶10、提取時間為20 min、提取溫度為50 ℃的條件下，考察酶加量對阿魏酸提取率的影響，結果如圖5所示。

圖5 酶加量對阿魏酸提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of ferulic acid

從圖5可知，當酶加量由 0.8%增至1.2%時，阿魏酸提取率逐漸升高；繼續增大酶加量，阿魏酸提取率明顯下降。因此，酶加量選擇1.2%較為適宜。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果(表2)

利用Minita18軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y=1.9918+0.0016A+0.1455B-0.0617C+0.1353D+0.0398A2-0.2296B2+0.0133C2-0.3730D2-0.0181AB-0.0176AC-0.0050AD-0.0818BC+0.2103BD+0.0328CD。

表2 響應面實驗設計及結果

對響應面模型進行統計學處理，方差分析結果如表3所示，標準化效應如圖6所示。

從表3、圖6可知，模型P=0.010，所建模型極顯著。因此，該模型的擬合程度良好，回歸方程具有統計學意義，可以利用該模型對阿魏酸提取率進行分析。對模型中回歸方程的各項系數進行顯著性檢驗，可知一次項B、D及交互項BD影響顯著，二次項B2、D2

表3 響應面模型的方差分析

圖6 標準化效應圖Fig.6 Diagram of standardized effect

影響極顯著。表明，料液比和提取溫度對阿魏酸提取率有顯著影響，各因素對阿魏酸提取率的影響大小依次為：料液比(B)>提取溫度(D)>提取時間(C)>酶加量(A)。

2.2.2 響應面分析

提取溫度與料液比、酶加量、提取時間的交互作用對阿魏酸提取率影響的響應面圖和等高線圖如圖7所示，多響應預測結果如表4所示。

從圖7可知，料液比對阿魏酸提取率的影響最為顯著，表現為曲線較陡。料液比和提取溫度的交互影響較為顯著，與方差分析的結果一致。從表4可知，新疆阿魏中阿魏酸的預測最佳提取工藝條件為：酶加量1.4%、料液比1∶13.19、提取時間10 min、提取溫度50.3 ℃，在此條件下，阿魏酸提取率為2.202%。

表4 多響應預測結果

2.3 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應組分對酪氨酸酶活性的抑制作用(圖8)

從圖8可知，阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應組分均對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性的特點，進一步表明阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應組分均可以通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素的合成。

3 結論

以阿魏酸提取率為指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化新疆阿魏中阿魏酸的超聲波輔助酶法提取工藝，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法評價阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。結果表明，新疆阿魏中阿魏酸的最佳提取工藝條件為：酶加量1.4%、料液比1∶13.19(g∶mL)、提取時間10 min、提取溫度50.3 ℃，在此條件下，阿魏酸提取率為2.202%。阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應組分均對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性的特點。可對阿魏酸進行結構改造和修飾，以開發出活性更強、毒副作用更小的阿魏酸類衍生物。

圖8 阿魏酸(a)及新疆阿魏中阿魏酸效應組分(b)對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibition of tyrosinase activity of ferulic acid and effective components of ferulic acid from Ferula sinkiangensis K.M.Shen.