康替唑胺體外抗菌作用研究

朱德妹，葉信予，胡付品，吳 湜，郭 燕，吳培澄

近年來快速發展的細菌耐藥性已為醫學界廣泛關注[1-3]。細菌耐藥性日趨嚴峻，尤其是甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（金葡菌）（MRSA）和凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）、青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRSP）、萬古霉素耐藥的腸球菌（VRE）以及MRSA中對萬古霉素敏感性下降的萬古霉素中介金葡菌（VISA）和萬古霉素耐藥金葡菌（VRSA）等，使感染性疾病的治療和控制面臨著嚴峻的挑戰[4]。唑烷酮類抗菌藥物是新型化學全合成抗菌藥物[5-7]。該類藥物具有獨特的抗菌作用機制，與現有的抗菌藥物無交叉耐藥。其抗菌譜包括了上述耐藥革蘭陽性菌的主要病原菌。其中已獲美國FDA批準上市的利奈唑胺，為唑烷酮類的第一個新藥[8]。該藥自2000年上市至今在治療MRSA、VRE等上述多重耐藥革蘭陽性菌所致的醫院和社區獲得性感染以及復雜性皮膚或皮膚軟組織感染中發揮了重要的作用。康替唑胺是盟科醫藥技術（上海）有限公司新研發的唑烷酮類抗菌新藥[5]。初期研究發現康替唑胺具有顯著的體外和體內抗革蘭陽性球菌的作用[5,9]。臨床前研究顯示康替唑胺雖與利奈唑胺屬同類抗菌藥物，其毒性靶器官與利奈唑胺相似，但對骨髓抑制毒性等顯著低于利奈唑胺[5,10]。目前該抗菌藥物已完成臨床藥理學等Ⅰ期臨床研究以及Ⅱ期和Ⅲ期的多中心臨床試驗，結果顯示康替唑胺對臨床常見革蘭陽性菌所致感染具有良好的臨床療效。現將前期已經完成的該藥體外藥效學研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌 收集2007—2008年浙江、新疆、上海、北京等省市19所醫院臨床分離菌共1 382株，均經本研究所相應的API菌種鑒定系統重新鑒定確認。質控菌為金葡菌ATCC 29213（MSSA）、ATCC 43300（MRSA），糞 腸 球 菌ATCC 29212（VSE）、ATCC 51299（VRE），屎 腸 球 菌ATCC 35667（VRE），肺炎鏈球菌ATCC 49619（青霉素中介肺炎鏈球菌，PISP），大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853，流感嗜血桿菌ATCC 49247、ATCC 49766，脆弱擬桿菌ATCC 25282。

1.1.2 抗菌藥物標準品和對照品 康替唑胺由盟科醫藥技術（上海）有限公司提供，利奈唑胺注射液為輝瑞制藥有限公司產品，亞胺培南-西司他丁為美國默沙東制藥公司產品，甲硝唑為Sigma公司參比藥品，萬古霉素等其他受試對照抗菌藥物均為中國食品藥品檢定研究院參比品。

1.1.3 藥敏試驗培養基 藥敏試驗采用的Meuller-Hinton （MH）瓊脂、Haemophilus test medium base（HTMB）及SR158添加劑、淋球菌GC培養基及L53生長補充專用培養基、GAM培養基均為英國OXOID公司產品。陽離子調節MH肉湯（CAMHB）為BBL公司產品。

1.2 方法

1.2.1 康替唑胺藥敏試驗 按美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）[11]推薦，采用瓊脂對倍稀釋法測定抗菌藥物對臨床分離菌的最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.2 康替唑胺最低殺菌濃度（MBC）和殺菌曲線 MBC定義為殺滅99.9%接種菌量的最低藥物濃度。按Amsterdam等[12]2005年描述的方法測定康替唑胺對180株臨床分離革蘭陽性菌的MBC；并對臨床分離MSSA、MRSA、糞腸球菌、肺炎鏈球菌以及質控菌株共11株細菌以1/2、1、2、4和8倍MIC濃度的康替唑胺進行殺菌曲線研究；以利奈唑胺和萬古霉素作為對照藥，設置不加藥的105CFU/mL菌液同步培養作為對照。

1.2.3 康替唑胺抗菌藥物后效應（PAE） 按Craig等[13]1996年描述的抗生素離心去除法測定康替唑胺對臨床分離MSSA、MRSA、PRSP、青霉素敏感肺炎鏈球菌（PSSP）各1株和金葡菌ATCC 29213、肺炎鏈球菌ATCC 49619標準菌株共6株革蘭陽性球菌的PAE。以不加藥的105CFU/mL菌液同步培養作為空白對照。觀察對照（C）和藥物處理（T）后細菌恢復生長1 lgCFU/mL所需的時間，并按PAE = T-C公式，計算PAE值。

1.2.4 培養條件對康替唑胺體外抗菌活性的影響 按Amsterdam等[12]2005年推薦的肉湯微量稀釋法測定不同培養條件下康替唑胺對80株臨床分離菌體外抗菌活性影響，包括不同pH（pH 5、pH 7、pH 9）的培養基、不同接種菌量（103CFU/mL、105CFU/mL、107CFU/mL）、不同血清蛋白濃度（25%、50%、75%）、含不同離子濃度的培養基和不同品牌藥敏試驗培養基的影響，以105CFU/mL的接種菌量、pH 7和不含血清蛋白的CAMHB肉湯為質控對照。

1.2.5 藥敏結果的判斷標準和資料統計 采用SPSS 20.0統計軟件進行藥敏資料的統計，并按CLSI 2009年M100-S19的標準[14]判斷需氧菌對抗菌藥物的藥敏結果。

2 結果

2.1 康替唑胺的體外抗菌作用

康替唑胺對所有受試革蘭陽性菌均顯示了高度的抗菌活性，該藥的MIC90均≤1 mg/L，包括甲氧西林耐藥葡萄球菌（MRS）、青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PISP和PRSP）和VRE，見表1。

表1 康替唑胺與相關抗菌藥物對臨床重要分離菌的藥敏結果Table 1 In vitro activities of contezolid and comparative antimicrobial agents against clinical isolates

康替唑胺對甲氧西林耐藥和敏感的葡萄球菌（MRSA、MSSA、MRSE、MSSE）、溶血葡萄球菌、其他凝固酶陰性葡萄球菌以及不產青霉素酶葡萄球菌的MIC90值均為0.5 mg/L（腐生葡萄球菌為1 mg/L除外），其抗菌活性略高于利奈唑胺（MIC90值=1 mg/L）、亦略高于替考拉寧和萬古霉素（表1、圖1）。康 替 唑 胺 對PSSP、PISP和PRSP的MIC90均為0.5 mg/L，對β溶血鏈球菌和分離自血液等無菌體液的草綠色鏈球菌MIC90均為1 mg/L，與利奈唑胺的MIC90值基本一致，抗菌活性亦相仿，但略低于萬古霉素和替考拉寧。康替唑胺對萬古霉素敏感糞腸球菌、屎腸球菌和其他腸球菌的MIC90均為1 mg/L，其抗菌作用與利奈唑胺和萬古霉素相仿、但略低于替考拉寧，并明顯優于其他各類受試藥；對于萬古霉素耐藥屎腸球菌的抗菌活性（MIC901 mg/L）則明顯高于萬古霉素和替考拉寧（MIC90≥128 mg/L），與利奈唑胺相仿。康替唑胺對棒狀桿菌屬細菌的抗菌作用與利奈唑胺、萬古霉素和替考拉寧相仿。見表1。

表1 （續）Table 1（continued）

表1 （續）Table 1（continued）

表1 （續）Table 1（continued）

表1 （續）Table 1（continued）

表1 （續）Table 1（continued）

表1 （續）Table 1（continued）

康替唑胺對所有受試的革蘭陰性菌的抗菌作用均差，包括受試的腸桿菌科細菌300株和不發酵糖革蘭陰性菌120株，其MIC50和MIC90均大于128 mg/L。其對淋病奈瑟菌20株和流感嗜血桿菌80株的抗菌活性亦低，MIC90均分別為16 mg/L和＞32 mg/L；但對卡他莫拉菌有一定的抗菌活性（MIC904 mg/L）。見表1。

表1 （續）Table 1（continued）

康替唑胺對受試的擬桿菌屬細菌、艱難梭菌和消化鏈球菌等厭氧菌有一定的抗菌作用。見表1。

康替唑胺對肺炎支原體和解脲脲原體等非典型病原體60株的抗微生物作用亦差，MIC90均＞32 mg/L。

2.2 康替唑胺的MBC和殺菌曲線

2.2.1 康替唑胺MBC 康替唑胺對180 株臨床分離革蘭陽性菌MBC 測定結果顯示對55% （33 /60）肺 炎 鏈 球 菌 的MBC為2～4倍MIC，對PSSP、PISP和PRSP肺炎鏈球菌的MBC90/MIC90均為8；但對其他受試革蘭陽性菌的MBC90/MIC90＞8。見表2。對照藥物利奈唑胺對上述受試菌株在相同實驗條件下，對肺炎鏈球菌PSSP、PISP和PRSP各20株的MBC90/MIC90均為4～8；對其他革蘭陽性菌的MBC90/MIC90亦均＞8；顯示康替唑胺的殺菌活性與利奈唑胺相仿。

圖1 康替唑胺和利奈唑胺對葡萄球菌的抗菌活性Figure 1 Activities of contezolid and linezolid against clinical isolates of Staphylococcus

2.2.2 康替唑胺殺菌曲線 康替唑胺對受試革蘭陽性菌的殺菌率及殺菌曲線見圖2，其4倍和8倍MIC濃度時均可對臨床分離的PSSP（07-W3-64）在（t+8）h達到99.9%殺菌率；對臨床分離PRSP（08-W19-36）則分別在（t+24）h和（t+10）h 達到99.9%的殺菌率；而對PISP（ATCC 49619）均在（t+24）h達到99.9%的殺菌率。對臨床分離的MSSA（08-W8-36）和MRSA（08-W10-50）（圖3）各1株，康替唑胺于4倍MIC時均可在24 h達99.9%的殺菌率，8倍MIC時分別在10 h和24 h達99.9%的殺菌率；但對受試的另1株MRSA（08-W9-88）和金葡菌標準菌株ATCC 29213在所試驗的濃度內均未達到99.9%的殺菌率。對臨床分離的糞腸球菌、屎腸球菌、萬古霉素耐藥屎腸球菌各1株和糞腸球菌ATCC 29212的殺菌曲線顯示均未達99.9%的殺菌率。

表2 康替唑胺對180株臨床分離菌的MIC和MBC值Table 2 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of contezolid against 180 clinical isolates

圖2 康替唑胺、利奈唑胺和萬古霉素對青霉素敏感肺炎鏈球菌07-W3-64的時間殺菌曲線Figures 2 Time-kill curves of contezolid, linezolid, and vancomycin against PSSP 07-W3-64

圖3 康替唑胺、利奈唑胺和萬古霉素對MRSA 08-W10-50的時間殺菌曲線Figures 3 Time-kill curves of contezolid, linezolid, and vancomycin against MRSA 08-W10-50

2.3 康替唑胺PAE

康替唑胺對臨床分離金葡菌和肺炎鏈球菌各3株的PAE測定結果顯示均有較明顯的PAE。當康替唑胺藥物濃度為2倍MIC時，對肺炎鏈球菌PAE的均值為（0.87±0.24）h，當濃度升至4倍和8倍MIC時，康替唑胺對肺炎鏈球菌的PAE均值分別 延長至（1.60±0.49） h和（2.84±0.82） h。同樣，當康替唑胺濃度為2倍MIC時，對金葡菌的PAE為（1.23±0.25） h，當濃度升至4倍和8倍MIC時PAE的均值分別延長至（1.68±0.28） h和（1.78±0.52）h。總體而言，隨著康替唑胺濃度的升高，PAE時間亦隨之延長；濃度越高，PAE則越長。康替唑胺對金葡菌的PAE范圍為0.9～2.4 h，均值為（1.56±0.42）h；對肺炎鏈球菌的PAE范圍為0.5～3.95 h，均值為（1.77±0.99）h。

2.4 培養條件對康替唑胺抗菌活性的影響

細菌接種菌量（包括MSSA、MRSA、PSSP、PISP、PRSP、化膿鏈球菌、糞腸球菌和屎腸球菌在內的80株臨床分離革蘭陽性菌）對康替唑胺MIC影響試驗測定結果見表3，103CFU/mL接種量時康替唑胺的MIC90值分別是接種量105CFU/mL值的0.5～1倍；接種量增加至107CFU/mL時康替唑胺的MIC50和MIC90值有顯著增高，均為105CFU/mL時MIC50和MIC90值的8～16倍。

表3 不同接種菌量對康替唑胺抗菌活性的影響Table 3 Effect of inoculum size on antimicrobial activity of contezolid and linezolid

采用pH 5、pH 7和pH 9三種CAMHB培養基對上述80株臨床分離革蘭陽性菌測定康替唑胺的MIC，結果三種培養基獲得的MIC50和MIC90值基本一致。見表4。

表4 不同pH對康替唑胺抗菌活性的影響Table 4 Effect of pH values of culture media on antimicrobial activity of contezolid and linezolid

采用含25%、50%和75%不同人血清蛋白濃度的CAMHB培養基對上述80株臨床分離革蘭陽性菌測定康替唑胺MIC，結果顯示與不含血清蛋白的CAMHB培養基時獲得的MIC90值相比，25%和50%血清蛋白濃度時，康替唑胺的MIC90值變化不明顯；當血清蛋白濃度增加至75%時，康替唑胺對部分細菌的MIC90值有升高，為不含血清蛋白CAMHB培養基時的2～4倍。見表5。

表5 不同血清蛋白濃度對康替唑胺抗菌活性的影響Table 5 Effect of serum concentration on antimicrobial activity of contezolid

含不同鈣、鎂離子濃度的培養基以及不同品牌的藥敏培養基測定康替唑胺對細菌MIC的結果顯示MIC50和MIC90值大致相仿。

3 討論

本組資料顯示康替唑胺對甲氧西林耐藥葡萄球菌（MRSA、MRSE和MRCNS）、青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PISP和PRSP）和VRE等具有多種耐藥機制的臨床重要革蘭陽性球菌及其敏感菌株均顯示高度的抗菌活性。值得注意的是康替唑胺對受試金葡菌中MSSA和MRSA的MIC90值均為0.5 mg/L，均較利奈唑胺（1 mg/L）低，提示其對金葡菌的抗菌活性略高于利奈唑胺，亦包括凝固酶陰性葡萄球菌。康替唑胺對其他受試革蘭陽性菌MIC90值均與利奈唑胺MIC90值相仿，提示與利奈唑胺一樣具有相同的抗革蘭陽性球菌的活性。1 mg/L的康替唑胺可100%抑制上述所有受試的各類敏感和耐藥的革蘭陽性球菌的生長。與其他受試抗菌藥物體外抗菌作用相比，康替唑胺與利奈唑胺一樣，與目前臨床沿用的抗革蘭陽性菌的抗菌藥物無交叉耐藥，與文獻報道一致[5-6，15]。本組資料顯示康替唑胺對半數以上肺炎鏈球菌（55%，33/60）的MBC為2～4倍MIC，殺菌曲線顯示4倍MIC濃度的康替唑胺均可在8～24 h內對3株受試肺炎鏈球菌（PSSP、PISP和PRSP）達99.9%的殺菌率，顯示其具有良好的殺菌作用。康替唑胺雖對40株金葡萄中個別菌株的MBC/MIC≤4MIC；但是95%菌株（38/40）的MBC90/MIC90≥8MIC，抑或甚達256 mg/L；對4株受試菌株的殺菌曲線結果顯示對其中2株金葡菌在4MIC（24 h）和8MIC（分別在10 h和24 h）濃度時可達99.9%的殺菌率（圖3）；但對其他2株受試金葡菌直至24 h均未能達到99.9%的殺菌率，此提示康替唑胺對某些金葡菌具殺菌作用，但對某些金葡菌的殺菌作用較為微弱。值得注意的是康替唑胺對腸球菌的MBC和殺菌曲線均顯示無一株細菌的康替唑胺MBC90/MIC90≤4MIC以下，亦無一株細菌的康替唑胺的殺菌曲線顯示殺菌率達99.9%，提示康替唑胺對腸球菌系抑菌劑作用。本組資料顯示康替唑胺對上述肺炎鏈球菌、金葡菌和腸球菌等的殺菌曲線和MBC的測定結果均與對照藥物利奈唑胺相仿。此研究結果與國內學者Li 等[9]2014年報道的結論一致。康替唑胺對肺炎鏈球菌和金葡菌均與利奈唑胺一樣具有良好的PAE，且隨著藥物濃度的升高，PAE延長。上述結果與文獻報道利奈唑胺的PAE結果一致[16]。

反映康替唑胺體內抗菌活性研究的小鼠全身感染模型和小鼠中性粒細胞減少性大腿感染模型的研究資料顯示，其對各種革蘭陽性菌包括耐多藥菌株所致的小鼠全身感染模型中康替唑胺的半數有效量（ED50）均低于或相似于利奈唑胺的ED50，顯示其具有和利奈唑胺相同或更好的療效[9]，如康替唑胺對金葡菌MRSA（ATCC 33591）、MRSA/VISA（Mu50）的ED50分別為2.36、2.50 mg/kg，顯著低于利奈唑胺的ED507.55、5.35 mg/kg ，差異具統計學意義（P＜ 0.01）；對MSSA（ATCC 29213）、MSSA（15）和MRSA（0850）的ED50分別為7.98、5.74、3.71 mg/kg與利奈唑胺的9.03、5.86、3.63 mg/kg相似（P＞ 0.05）。在對肺炎鏈球菌，包括PSSP、PISP（ATCC 49619）和PRSP菌株，以及糞腸球菌VSE（ATCC 29212）、VRE（EFL4041）和HLGR-VSE HH22（HH22）的小鼠全身感染模型的體內抗菌活性測定資料亦均顯示康替唑胺與利奈唑胺有較高的相似療效。同時在小鼠大腿感染模型中，康替唑胺在大多數實驗劑量下，小鼠大腿的菌落計數顯著低于相應對照組（P＜ 0.01）。康替唑胺和利奈唑胺對金葡菌ATCC 29213（MSSA）和金葡菌0605（臨床株MSSA）引起的小鼠大腿中性粒細胞感染具有相似的療效。國內有關小鼠全身感染模型和大腿感染模型的研究結果[9]進一步驗證和反映了本研究的結果。

本研究結果顯示康替唑胺對臨床重要的需氧革蘭陽性菌具有良好的抗菌作用，尤其是對一些需氧革蘭陽性球菌中的耐藥菌株（MRSA、PRSP、VRE等）均具有高度抗菌活性。其對肺炎鏈球菌包括PISP和PRSP具有殺菌活性；并對肺炎鏈球菌和金葡菌具有較長的PAE；其對葡萄球菌的抗菌活性略優于利奈唑胺；其對大多革蘭陽性菌的抗菌作用與糖肽類抗生素萬古霉素、替考拉寧的作用相仿；對VRE的抗菌作用與利奈唑胺一樣，遠優于萬古霉素和替考拉寧。本研究結果均提示康替唑胺是需氧革蘭陽性菌感染的適宜選用藥物，包括由上述多重耐藥株所致的感染，有望用于臨床敏感革蘭陽性菌感染的治療。